華瑩 王慧 李濤 王開功 文明 周碧君 程振濤

（1，貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550008；2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025；3，貴州省動(dòng)物疫病研究室 550025）

一例野豬感染豬瘟病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

華瑩1王慧1李濤1王開功2，3文明2，3周碧君2，3程振濤2，3

（1，貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550008；2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025；3，貴州省動(dòng)物疫病研究室 550025）

采集兩頭臨床癥狀疑似豬瘟的病死野豬內(nèi)臟組織，應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。經(jīng)細(xì)菌分離鑒定，未發(fā)現(xiàn)典型致病菌感染；經(jīng)PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)，確診該病例為豬瘟病毒感染所致。

野豬；豬瘟；實(shí)驗(yàn)室診斷；PCR；熒光定量RTPCR

豬瘟（Classical swine fever，CSF） 是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[1-3]。該病在世界各地均有不同程度流行，典型特征為發(fā)病急、高熱稽留，全身廣泛性出血，腸紐扣狀潰瘍，脾臟邊緣梗死和腎密集點(diǎn)狀出血[4，5]。

2014年11月，貴州省某養(yǎng)豬場(chǎng)所飼野豬陸續(xù)出現(xiàn)死亡病例。病豬出現(xiàn)精神沉郁、厭食、消瘦，結(jié)膜潮紅，耳、四肢及腹下皮膚呈現(xiàn)不同程度的紫紅色。解剖病死野豬，可見全身性出血，肺臟水腫淤血，脾臟邊緣有出血性梗死灶，腎臟腫大出血及全身淋巴結(jié)腫大出血。為確診病因，對(duì)兩頭病死野豬內(nèi)臟組織進(jìn)行了分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，最終確診為豬瘟病毒感染?，F(xiàn)將病例診斷情況介紹如下，以期為預(yù)控疫病流行暴發(fā)提供技術(shù)支持和診斷參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料采自貴州省某養(yǎng)豬場(chǎng)兩頭病死野豬病變內(nèi)臟組織（脾臟、腎臟及淋巴結(jié)）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV）RNA提取試劑盒及普通RTPCR、熒光RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，均購(gòu)自北京世紀(jì)元亨有限公司；細(xì)菌分離培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 細(xì)菌檢測(cè)

無(wú)菌采取病死野豬肝臟、脾臟、心臟進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。同時(shí)無(wú)菌操作劃線接種血清瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察其特征。

1.3 PRRSV、CSFV核酸檢測(cè)

1.3.1 總RNA提取

取病死野豬的脾臟、腎臟及淋巴結(jié)無(wú)菌研磨成組織勻漿液，以13000rpm離心3min。取上清液，按照世紀(jì)元亨試劑盒說(shuō)明書提取病料總RNA。以針對(duì)PRRSV和CSFV的世紀(jì)元亨普通RT-PCR和熒光RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行定性和實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。

1.3.2 PRRSV、CSFV特異性擴(kuò)增

取提取的病料總RNA，分別以針對(duì)PRRSV和CSFV的世紀(jì)元亨普通RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定。

1.3.3 CSFV實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增

取提取的病料總RNA，以針對(duì)CSFV的世紀(jì)元亨熒光RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

無(wú)菌采取病死野豬肝臟、脾臟、心臟制成涂片，經(jīng)瑞氏染色鏡檢，未見典型的致病菌。

2.2 PRRSV、CSFV特異性擴(kuò)增結(jié)果

以世紀(jì)元亨PRRSV和CSFV普通RT-PCR核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的病料總RNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1、圖2：

圖1 PRRSV特異性RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可知，從病死野豬組織所提基因組RNA中均未出現(xiàn)PRRSV特異性擴(kuò)增條帶；由圖2可知，從病死野豬組織所提基因組RNA中有5份出現(xiàn)大小為235bp左右的CFSV特異性擴(kuò)增條帶。初步表明病死野豬感染了CSF，而未感染PRRS。

圖2 CSFV特異性RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 CSFV實(shí)時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果

以世紀(jì)元亨CSFV通用熒光RT-PCR核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的病料總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。

圖3 CSF實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖3可知，從病死豬組織所提基因組RNA中有5份出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。

圖4 CSFV實(shí)時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果

從圖4中可見，CT值在21.4415～26.9073范圍內(nèi)。根據(jù)說(shuō)明書結(jié)果判定CT值＜30且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，為CSF陽(yáng)性，初步判定該病死豬為PRRS感染所致。

3 討論

豬瘟是我國(guó)四大動(dòng)物疫病之一，至今已流行80多年，是發(fā)生最多、危害最大、流行最廣的傳染病[6-8]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)我國(guó)因病死亡的豬占飼養(yǎng)總數(shù)的8～10%，其中約30%是由豬瘟致死[9]，而且豬瘟的流行與發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，在臨床表現(xiàn)上也更加復(fù)雜，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，給豬瘟的臨床診斷帶來(lái)了很大困難[10]。同時(shí)CSF剖檢病變與PRRS等疾病極其相似，這給CSF的臨床診斷造成了較大困難[11]。而試驗(yàn)證明應(yīng)用熒光RT-PCR方法進(jìn)行CSFV檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合臨床癥狀可作出快速診斷[12，13]。熒光定量PCR具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)此方法能夠?qū)崿F(xiàn)定量，通過(guò)定量可以對(duì)感染狀況進(jìn)行初步判斷，因而得到廣泛應(yīng)用[14-16]。在國(guó)內(nèi)外該技術(shù)也已用于豬瘟病毒的定量檢測(cè)[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)方法對(duì)臨床表現(xiàn)精神沉郁、消瘦、四肢及腹下皮膚呈現(xiàn)不同程度的紫紅色等癥狀病死野豬進(jìn)行了病因確定性診斷。本次診斷依照農(nóng)業(yè)部有關(guān)規(guī)定，對(duì)臨床疑似CSF病例進(jìn)行了實(shí)施RT-PCR及熒光RTPCR雙重檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確診該病例為CSF感染所致。

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華瑩（1982-），女，漢族，貴州省貴陽(yáng)市人，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)在讀博士，主要從事動(dòng)物疫病病原學(xué)研究。