潘軒，李璟，熊蕾，唐文峴，張君，汪保和，3

1.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081；2.湖南省老年醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410016；3.湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410081

將細(xì)胞培養(yǎng)器皿或其放置容器內(nèi)的空氣抽出，充入組分不同或組分配比不同的氣體，這是建立細(xì)胞培養(yǎng)氣體環(huán)境的一種方法。然而，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中沿用的抽氣-充氣方法存在一些不足之處，主要問(wèn)題是氣體組分定量困難、適用面不寬、耗氣多、耗時(shí)長(zhǎng)等[1-3]。本文報(bào)告一種定量抽氣-充氣法及其相配的抽氣-充氣裝置和配氣-輸氣裝置，能更好地用于細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境的建立和維持，以及細(xì)胞培養(yǎng)基的預(yù)先氣體平衡。

1 材料與方法

1.1 抽氣-充氣裝置的構(gòu)造

如圖1、2 所示，抽氣-充氣裝置由培養(yǎng)容器口組件、抽氣組件、氣體組分充入組件、檢壓計(jì)和氣壓平衡袋構(gòu)成。培養(yǎng)容器是指細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)器皿放置盒等容器（本文統(tǒng)稱培養(yǎng)容器），培養(yǎng)容器口組件包括密封塞（或蓋）、抽氣管和充氣管。抽氣組件包括負(fù)壓瓶、注射器、二通閥、三通閥1 和連接管。負(fù)壓瓶口由硅膠瓶塞密封，瓶塞中貫穿吸氣管和抽水管。吸氣管的瓶?jī)?nèi)端與瓶塞下表面相平，瓶外端與三通閥1 連接。三通閥1 的另兩個(gè)端口分別經(jīng)管道與培養(yǎng)容器口抽氣管和檢壓計(jì)連接。抽水管的瓶?jī)?nèi)端接近瓶底，瓶外端依次串接二通閥和注射器。氣體組分充入組件包括氣體過(guò)濾器（用于阻擋氣體中的微生物和雜質(zhì)微粒）、三通閥2、貯氣袋、氣體注射器和連接管。氣體過(guò)濾器的一端連接于培養(yǎng)容器口充氣管，另一端與三通閥2 連接，三通閥2 的另兩個(gè)端口分別連接貯氣袋和氣體注射器。氣壓平衡袋為小容量醫(yī)用輸液袋，使用時(shí)，將其與三通閥1連接。

圖1 抽氣-充氣裝置結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 本實(shí)驗(yàn)室自制抽氣-充氣裝置

1.2 抽氣-充氣裝置的使用

在等溫條件下，將培養(yǎng)容器內(nèi)1/2 的氣體抽出，接著向容器內(nèi)充入氣體，其組分或組分配比與抽出氣體不同，而體積與抽出氣體相等。如此進(jìn)行的一次抽氣和一次充氣計(jì)為一輪抽氣-充氣。培養(yǎng)容器內(nèi)氣體環(huán)境的建立需要R（≥1）輪抽氣-充氣，前R-1輪抽氣-充氮或抽氣-充氧，第R輪抽氣-充氣將滿足所需配比的各種氣體組分充入容器。

1.2.1 抽氣-充氣輪數(shù)的計(jì)算

①培養(yǎng)容器內(nèi)需O2濃度低于大氣O2濃度的混合氣體，進(jìn)行R輪抽氣-充氣時(shí)，前R-1輪充入N2，第R輪充入各種氣體組分，達(dá)到組分配比的要求。用式（1）計(jì)算所需的抽氣-充氣輪數(shù)R：

式中，Rl-O2為培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間O2體積分?jǐn)?shù)減至一定數(shù)值所需抽氣-充氣輪數(shù)；Fi-O2為抽氣-充氣前培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間的O2體積分?jǐn)?shù)，一般實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下，其取值是20.0%；Fc-O2為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間所需O2體積分?jǐn)?shù)。

若算得Rl-O2是正整數(shù)，直接用其作為實(shí)際操作的抽氣-充氣輪數(shù)R；若算得Rl-O2是正分?jǐn)?shù)，則用比其大的最小正整數(shù)作為實(shí)際操作的抽氣-充氣輪數(shù)R。

②培養(yǎng)容器內(nèi)需O2濃度高于大氣O2濃度的混合氣體，進(jìn)行R輪抽氣-充氣時(shí)，前R-1輪充入O2，第R輪充入各種氣體組分，達(dá)到組分配比的要求。用式（2）計(jì)算所需的抽氣-充氣輪數(shù)R：

式中，Rh-O2為培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間O2體積分?jǐn)?shù)增至一定數(shù)值所需抽氣-充氣輪數(shù)。

按算得的Rh-O2，實(shí)際操作所用抽氣-充氣輪數(shù)R的取值方法與Rl-O2相同。

1.2.2R-1 輪抽氣-充氣后培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間O2體積分?jǐn)?shù)的計(jì)算

用式（3）計(jì)算R-1輪抽氣-充氮后培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間O2體積分?jǐn)?shù)Fl-O2：

用式（4）計(jì)算R-1輪抽氣-充氧后培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣相空間O2體積分?jǐn)?shù)Fh-O2：

1.2.3 第R輪抽氣-充氣中培養(yǎng)容器內(nèi)需充入氣體組分體積的計(jì)算

用式（5）計(jì)算第R輪抽氣-充氣中需充入培養(yǎng)容器內(nèi)的氣體組分體積Vgc：

式中，Vgc包括Vgc-O2、Vgc-CO2、Vgc-N2、Vgc-X，X 表示非O2/非CO2/非N2氣體；Fc為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間所需氣體組分體積分?jǐn)?shù)，包括Fc-O2、Fc-CO2、Fc-N2和Fc-X，其中Fc-N2=100%-（Fc-O2+Fc-CO2+Fc-X+Fc-Va），F(xiàn)c-Va表示細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)容器內(nèi)水蒸汽的體積分?jǐn)?shù)；Fpr為R-1 輪抽氣-充氣后培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間氣體組分的體積分?jǐn)?shù)，包括Fpr-O2、Fpr-CO2、Fpr-N2和Fpr-X，其中Fpr-O2包括Fl-O2和Fh-O2，F(xiàn)pr-CO2和Fpr-X均等于0，F(xiàn)pr-N2=100%-（Fpr-O2+Fpr-CO2+Fpr-X+Fpr-Va）；Vgcp為培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間的體積；Ti為周圍環(huán)境（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)）絕對(duì)溫度（K）；Tc為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)容器內(nèi)絕對(duì)溫度（K）。

1.2.4 抽氣-充氣操作方法

抽氣-充氣裝置的部件經(jīng)滅菌處理備用，抽氣-充氣操作在超凈工作臺(tái)的無(wú)菌條件下進(jìn)行，操作步驟如下：①安裝好培養(yǎng)容器口組件；在負(fù)壓瓶?jī)?nèi)裝滿蒸餾水，用瓶塞緊塞瓶口；②連通培養(yǎng)容器與負(fù)壓瓶，用注射器將負(fù)壓瓶?jī)?nèi)水抽出，當(dāng)抽出水體積等于培養(yǎng)容器內(nèi)氣相空間+抽氣管路內(nèi)腔之和時(shí)，停止抽水，關(guān)閉三通閥1；③連通培養(yǎng)容器與N2或O2貯氣袋，貯氣袋內(nèi)氣體進(jìn)入培養(yǎng)容器；④連通培養(yǎng)容器和檢壓計(jì)，適度擠壓貯氣袋，將袋內(nèi)氣體繼續(xù)充入容器；當(dāng)容器內(nèi)氣壓與周圍大氣壓相等時(shí)，停止擠壓貯氣袋，關(guān)閉三通閥1 和2；⑤如果抽氣-充氣輪數(shù)R≥3，重復(fù)進(jìn)行步驟②～④，直至完成R-1輪抽氣-充氣；⑥重復(fù)步驟②；⑦用氣體注射器從貯氣袋內(nèi)抽取體積Vgc的一種氣體組分，將氣體組分注入培養(yǎng)容器；如此重復(fù)操作，將所需各種氣體組分注入培養(yǎng)容器；⑧取下抽氣組件和氣體組分充入組件，在三通閥1上連接氣壓平衡袋或配氣-輸氣裝置（下述）。

1.3 配氣-輸氣裝置的構(gòu)造

為了抵消培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞消耗O2和產(chǎn)生CO2的影響，維持培養(yǎng)容器內(nèi)氣體組分濃度的穩(wěn)定，可向容器內(nèi)輸送既定組分配比的混合氣體，配氣-輸氣裝置用于混合氣體的配制和輸送。

如圖3、4 所示，配氣-輸氣裝置由通水動(dòng)力瓶、配氣袋、檢壓計(jì)、蠕動(dòng)泵、氣體過(guò)濾器、濕化瓶、氣閥和連接管路組成。通水動(dòng)力瓶的主體是下嘴玻璃瓶，其容量為2～5 L，瓶口由硅膠塞密封，瓶塞中貫穿排氣管和通氣管。排氣管的瓶?jī)?nèi)端與瓶塞的下表面相平，其瓶外端連接硅膠管。通氣管的瓶?jī)?nèi)端伸入玻璃瓶?jī)?nèi)約2 cm，連接配氣袋；瓶外端連接三通閥1。三通閥1 的另兩個(gè)端口分別連接貯氣袋和三通閥2。在三通閥2的另兩個(gè)端口上，一個(gè)連接檢壓計(jì)，一個(gè)依次串接三通閥3、氣體過(guò)濾器和濕化瓶。濕化瓶口由瓶塞密封，瓶塞中貫穿進(jìn)氣管和輸氣管，進(jìn)氣管的瓶?jī)?nèi)端接近瓶底，瓶外端連接氣體過(guò)濾器；輸氣管的瓶?jī)?nèi)端與瓶塞下表面相平，瓶外端經(jīng)硅膠管與培養(yǎng)容器口組件的充氣管連接。通水動(dòng)力瓶的下嘴也由硅膠塞密封，一根通水管貫穿下嘴塞。通水管的瓶外端連接三通閥4，三通閥4的另兩個(gè)端口分別連接蠕動(dòng)泵和放水管。

1.4 配氣-輸氣裝置的使用

①用式（6）計(jì)算配氣袋內(nèi)配制混合氣體所需各種氣體組分的體積：

圖3 配氣-輸氣裝置結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 本實(shí)驗(yàn)室自制配氣-輸氣裝置

式中，Vgc'為配氣袋內(nèi)需充入的氣體組分體積；Fc和Fc-Va同式（5）；Vm為配氣袋內(nèi)需配混合氣體的體積；②在通水動(dòng)力瓶?jī)?nèi)加約一滿瓶水，用注射器將配氣袋內(nèi)氣體抽凈，將配氣袋置入瓶?jī)?nèi)，并用硅膠塞緊塞瓶口；③通過(guò)通水管向玻璃瓶?jī)?nèi)注水，使瓶?jī)?nèi)水面上方的氣體經(jīng)排氣管排出，然后將排氣管夾閉；④取裝有第1 種氣體組分的貯氣袋，將其與三通閥1 連接，使配氣袋與貯氣袋連通，也與檢壓計(jì)連通；⑤由放水管放出通水動(dòng)力瓶?jī)?nèi)的水，貯氣袋內(nèi)氣體進(jìn)入配氣袋，當(dāng)放出水的體積達(dá)到第1 種氣體組分所需體積Vgc'時(shí)，停止放水；在配氣袋內(nèi)氣壓與周圍大氣壓平衡的狀態(tài)下，關(guān)閉三通閥1；⑥用裝有第2 種氣體組分的貯氣袋替換第1 種氣體組分貯氣袋，按步驟④和⑤同法操作，將第2 種氣體組分充入配氣袋內(nèi)；如此類推，將第3 種或更多種氣體組分充入配氣袋；然后，取下配氣-輸氣裝置上的貯氣袋和檢壓計(jì)；⑦在濕化瓶中加接近一滿瓶37℃無(wú)菌蒸餾水，塞緊瓶塞，連通配氣袋與濕化瓶；⑧開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，以一定流速向通水動(dòng)力瓶?jī)?nèi)注水，配氣袋內(nèi)的混合氣體經(jīng)濕化瓶輸氣管排至外界；當(dāng)管路中充滿配氣袋內(nèi)輸出的混合氣體時(shí)，將與輸氣管與培養(yǎng)容器口充氣管連接，并打開(kāi)培養(yǎng)容器口抽氣管上的三通閥；調(diào)低蠕動(dòng)泵向玻璃瓶?jī)?nèi)注水的流速（一般可為10～100 L/min），使配氣袋內(nèi)混合氣體輸入培養(yǎng)容器。

1.5 氣體組分體積分?jǐn)?shù)的檢測(cè)

開(kāi)啟空調(diào)，保持室溫為20℃；在25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入DMEM 培養(yǎng)液2.5 mL，使用上述抽氣-充氣裝置，以Ti=293K、Tc=310K、N2為平衡氣，在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分別混配O2和CO2不同配比（見(jiàn)結(jié)果部分）的4 種混合氣體；通過(guò)培養(yǎng)容器口組件向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)注入DMEM培養(yǎng)液10 mL，同時(shí)從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)抽出10 mL 混合氣體；將抽出的混合氣體注入放有干燥劑片并已抽真空的塑料袋中，5 min 后從袋內(nèi)抽出干燥的混合氣，注入CO2和氧氣記錄分析儀（TFS-CO2/O2 型，株洲市拓達(dá)電子有限公司），檢測(cè)O2體積分?jǐn)?shù)和CO2體積分?jǐn)?shù)；將檢測(cè)值乘以0.94（Fc-Va=6%），算出培養(yǎng)瓶氣相空間的O2和CO2體積分?jǐn)?shù)。

使用配氣-輸氣裝置，在其配氣袋內(nèi)，以Fc-Va=6%、N2為平衡氣，分別混配O2和CO2不同配比（見(jiàn)結(jié)果部分）的4 種混合氣體；向配氣袋所在下嘴玻璃瓶?jī)?nèi)注水10 mL，從配氣袋內(nèi)抽出10 mL混合氣體，用上述CO2和氧氣記錄分析儀檢測(cè)O2體積分?jǐn)?shù)和CO2體積分?jǐn)?shù)。

1.6 培養(yǎng)基氣體平衡

配制含20%胎牛血清的DMEM 液，加入30 mL容量的玻璃瓶中，每瓶10 mL，塞緊硅膠瓶塞；用抽氣-充氣裝置，分別在這些玻璃瓶?jī)?nèi)配制3 種混合氣體，O2濃度分別為1%、20%、40%，各種混合氣體的CO2濃度均為10%，均用N2作為平衡氣體；將配好混合氣體的玻璃瓶置于水平回旋搖床，以10/min 的頻率回旋30 min，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 MC-3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)

用胰酶法將貼壁生長(zhǎng)至亞融合的MC-3T3-E1細(xì)胞消化下來(lái)，離心洗滌后重懸，計(jì)數(shù)，制成含10%胎牛血清的DMEM 單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度1×104/mL。將單細(xì)胞懸液種入12.5 cm2培養(yǎng)瓶，2.5 mL/瓶。細(xì)胞分為1%、20%、80% O2濃度組，各組CO2濃度均為10%，N2作為平衡氣體。各組培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的混合氣體均用前述抽氣-充氣法配制。將各組細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h 后行Wright-Giemsa染色，按參考文獻(xiàn)[4]做原位細(xì)胞計(jì)數(shù)，拍照。

1.8 CFU-F集落形成實(shí)驗(yàn)

用頸椎脫臼法處死KM 小鼠，無(wú)菌條件下取股骨和脛骨骨髓，制成骨髓單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。骨髓細(xì)胞混懸于含20%胎牛血清的DMEM 液中，細(xì)胞濃度1×106/mL，種入35 mm 培養(yǎng)皿，2 mL/皿。細(xì)胞分為1%、20%、40% O2濃度組，各組CO2濃度均為10%，N2作為平衡氣體。各組培養(yǎng)皿分別放入自制的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境盒，用前述抽氣-充氣法在各組環(huán)境盒內(nèi)配制混合氣體。將環(huán)境盒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d 后，吸出培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，換入前述已做氣體平衡培養(yǎng)液。將培養(yǎng)皿再放入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境盒，仍按上述組分配比分別在3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的環(huán)境盒內(nèi)配制混合氣體，并使用前述配氣-輸氣裝置配制與環(huán)境盒內(nèi)組分配比相同的混合氣體，以20 L/min的流速將混合氣體分別輸入環(huán)境盒，在37℃下培養(yǎng)，每天輸氣12 h。繼續(xù)培養(yǎng)7 d 后，行Wright-Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)CFU-F集落（≥20個(gè)成纖維細(xì)胞的聚合計(jì)為1個(gè)集落），拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混配氣體的組分體積分?jǐn)?shù)

培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)4 種混合氣體的O2和CO2體積配比預(yù)定值見(jiàn)表1。在各種配比的混合氣體中，O2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值在1%以內(nèi)。配比1 混合氣體的O2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值僅0.17%，但由于預(yù)定值小，誤差達(dá)17%；配比2、3、4 混合氣體的O2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值相對(duì)于預(yù)定值的誤差≤6%。各種配比混合氣體的CO2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值在1.2%以內(nèi)，誤差＜12.0%。

2.2 配氣袋內(nèi)混配氣體的組分體積分?jǐn)?shù)

配氣袋內(nèi)4 種混合氣體的O2和CO2體積配比預(yù)定值見(jiàn)表2。配比1 混合氣體的O2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值為0.13%，誤差為11%；配比2、3、4混合氣體的O2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值在0.8%以內(nèi)，誤差＜3%。各種配比混合氣體中，CO2體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)值與預(yù)定值的差值在0.5%以內(nèi)，誤差＜6%。

2.3 不同O2濃度條件下MC-3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)

在1%、20%和80% O2濃度培養(yǎng)條件下，MC-3T3-E1 細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯差異，培養(yǎng)瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果依次為（96.5±29.6）×103、（250.4±81.0）×103和（8.8±3.9）×103。與20% O2組比，1% O2組和80% O2組的細(xì)胞數(shù)均減少，差異均有顯著性意義（圖5）。

2.4 不同O2濃度培養(yǎng)條件下CFU-F集落的形成

在1%、20%和40% O2濃度的培養(yǎng)條件下，小鼠骨髓CFU-F 集落的生成表現(xiàn)出明顯差異（圖7），每106骨髓有核細(xì)胞的CFU-F 集落數(shù)依次為8.0±3.3、17.7±4.7 和2.3±0.8。與20% O2組比，1% O2組和40% O2組的CFU-F集落形成率均減低，差異均有顯著性意義（圖6）。

表1 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體組分體積分?jǐn)?shù)的預(yù)定值和檢測(cè)值（n=3）

表2 配氣袋內(nèi)氣體組分體積分?jǐn)?shù)的預(yù)定值和檢測(cè)值（n=3）

3 討論

上述混配氣體組分體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果表明，在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)和培養(yǎng)器皿放置容器內(nèi)，用定量抽氣-充氣法（該方法已獲專利授權(quán)，專利號(hào)201420836800.2）能直接配制細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境所需組分配比的混合氣體；細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步證明了這種抽氣-充氣法用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的可靠性和有效性。這種方法也能用于細(xì)胞培養(yǎng)基的預(yù)先氣體平衡。

不論在細(xì)胞培養(yǎng)器皿或其放置容器內(nèi)建立細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境，還是在細(xì)胞培養(yǎng)基貯器內(nèi)進(jìn)行預(yù)先氣體平衡，都須將容器內(nèi)空氣置換成一定組分配比的混合氣體。常用方法是將已配好的混合氣體持續(xù)通入容器，同時(shí)使容器內(nèi)的空氣排出，通過(guò)逐漸稀釋作用，建立細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境[5-7]。這一方法費(fèi)時(shí)費(fèi)氣，并且需要預(yù)配混合氣體。為克服其弊端可采用另一種方法，即先將容器中的原有氣體部分抽出，然后把組分氣體和被試氣體定量充入容器[3,8-9]。這種方法要求抽氣和充氣定量進(jìn)行，但是其定量問(wèn)題并未得到有效可行的解決[10-11]。本文報(bào)道了用于定量抽氣-充氣的一系列公式，這些公式的推導(dǎo)除了以抽氣-充氣容器內(nèi)氣相空間體積、容器內(nèi)原有氣體的組分濃度和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境所需氣體組分濃度為基本參數(shù)，還充分考慮了水蒸汽和溫度等因素。在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)溫度（37℃）下，水蒸汽在氣相環(huán)境中所占體積比約達(dá)6%；一般室溫與細(xì)胞培養(yǎng)溫度具有一定的差值，對(duì)培養(yǎng)器皿或其放置容器內(nèi)抽氣和充氣的定量產(chǎn)生影響[12]，而在以往細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境的建立中，忽略了這些因素的影響[13]。將這些公式用于抽氣-充氣的定量計(jì)算，能更好地滿足細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境中各種組分和被試氣體的定量要求。

圖5 不同O2濃度培養(yǎng)條件下MC-3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)

圖6 不同O2濃度培養(yǎng)條件下CFU-F集落的形成

在操作上，本文的抽氣-充氣法比細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)沿用的抽氣-充氣法更為簡(jiǎn)便實(shí)用。使用注射器進(jìn)行手工操作，就能將容器內(nèi)1/2 的氣體抽出，而不必用電動(dòng)真空泵抽氣。借助與被抽氣容器相連通的負(fù)壓瓶，通過(guò)從瓶?jī)?nèi)抽水造成負(fù)壓而抽出容器內(nèi)氣體，使得抽氣定量更加自如，抽氣量不受注射器容量的限制。抽氣之后的容器內(nèi)充氣可由貯氣袋直接輸入，或用注射器從袋內(nèi)抽取氣體后注入容器。通過(guò)氣體組分定量加入容器，能在容器內(nèi)建立各種氣體組分配比的氣相環(huán)境，不須預(yù)先配好混合氣體，還省時(shí)省氣。而且，使用貯氣袋裝納組分氣體和被試氣體，可用氣體種類多、來(lái)源廣，除了市售氣體，還可采集各種環(huán)境氣體和實(shí)驗(yàn)室自制氣體，不受氣體量少的限制。因此，本文的抽氣-充氣法除了能方便地用于各級(jí)O2、CO2和N2濃度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，也能方便地用于研究各種環(huán)境污染氣體、麻醉氣體和其他氣體生物效應(yīng)和有害作用的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

直接在培養(yǎng)容器內(nèi)建立所需氣相環(huán)境后，如果在容器密閉條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞代謝的O2消耗和CO2產(chǎn)生將使氣相環(huán)境的氣體組分濃度有所改變。為了嚴(yán)格維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的O2和CO2濃度的穩(wěn)定，可向容器內(nèi)輸送既定組分配比的混合氣體。本文所述配氣-輸氣裝置運(yùn)用水-氣等量置換技術(shù)，能按組分配比要求配制各種組分濃度的混合氣體，并能將所配混合氣體控速輸入細(xì)胞培養(yǎng)器皿或其放置容器（已申請(qǐng)?jiān)撗b置的專利，申請(qǐng)?zhí)?01310365440.2）。如果細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間較短，相對(duì)于容器內(nèi)O2和CO2總量來(lái)說(shuō)，細(xì)胞的O2消耗量和CO2產(chǎn)生量極少，培養(yǎng)環(huán)境中O2和CO2濃度的變化可被忽略[14]。這種情況下，可不必向容器內(nèi)輸送氣體。但是，將容器密閉從室溫條件下放入恒溫培養(yǎng)箱后，升溫性氣體膨脹將使容器內(nèi)氣壓高于周圍大氣壓[15]。使用本文所述氣壓平衡袋，能簡(jiǎn)單而可靠地保持培養(yǎng)容器內(nèi)氣壓與周圍大氣壓之間的平衡。

總之，本文所述抽氣-充氣法及相配裝置的可靠性高、適用性強(qiáng)、費(fèi)用低廉，可作為細(xì)胞培養(yǎng)氣相環(huán)境建立和維持方法和裝置的有益選擇。

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