栗辰 ，靳彥文，劉曉靜，進(jìn)淑娟，韓小偉，龐漢民，郝曉鵬，曹誠，黃焰

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.附屬307醫(yī)院乳腺外科，北京 100071；b.生物工程研究所，北京 100850

乳腺癌是影響女性健康的主要惡性腫瘤之一。乳腺癌易感基因BRCA1、BRCA2（BRCA1/2）是目前研究最確切的與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的2 個(gè)基因，具有明顯的家族遺傳性。國內(nèi)至今尚無針對漢族家族性乳腺癌患者的BRCA1/2的大樣本篩查，小樣本的BRCA1/2基因突變研究表明這2 個(gè)基因突變存在地域、種族差異。此外，針對家族性乳腺癌患者健康親屬（即健康遺傳性高危人群）的BRCA1/2突變的篩查基本空白。我們采用PCR-DNA 直接測序技術(shù)，對54例家族性乳腺癌患者及24例健康遺傳性高危人群進(jìn)行BRCA1/2全編碼外顯子基因序列檢測，旨在進(jìn)一步研究中國漢族女性家族性乳腺癌患者及健康高危人群中BRCA1/2基因的突變情況。

1 資料與方法

1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)及研究對象

1.1.1 家族性乳腺癌患者 ①本人經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為乳腺癌患者；②具有血緣關(guān)系的近親（一級、二級、三級親屬）中至少1人患乳腺癌和（或）卵巢上皮癌；③個(gè)體出現(xiàn)2 個(gè)原發(fā)性乳腺癌；④具有血緣關(guān)系的男性近親患有乳腺癌。

1.1.2 健康遺傳性高危人群 ①本人無乳腺癌和（或）卵巢上皮癌；②有符合以上家族性乳腺癌患者條件的一級或二級親屬；③三級親屬中至少有2名患乳腺癌和（或）卵巢上皮癌。

1.1.3 研究對象 分為2 組：①2013 年12 月～2014年10月就診于解放軍307醫(yī)院乳腺外科的漢族女性乳腺癌患者共54例；②24例健康高危人群主要來自同時(shí)期解放軍307 醫(yī)院乳腺外科家族性乳腺癌患者的健康女性親屬。所有研究對象知情同意后，每人抽取外周靜脈血5 mL 于EDTA 抗凝管，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 全血基因組提取

用QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）提取樣本全血基因組DNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中BRCA1、BRCA2基因序列，由北京奧科鼎盛公司合成引物序列，覆蓋BRCA1、BRCA2基因的所有編碼外顯子。用Veriti Thermal Cycler（Applied Biosystems）PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行所有擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)總體積為50μL，包括模板DNA 2μL，上、下游引物各2μL，ddH2O 19μL，2×TaqPCR MasterMix 25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃1 min預(yù)變性，然后以95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s 行6 循環(huán)，以95℃變性30 s、60℃退火15 s、72℃延伸55 s行40循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳分析

1.0%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察判斷正確條帶，對瓊脂糖凝膠電泳分析未出現(xiàn)亮帶的PCR樣品重新行PCR 擴(kuò)增，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA直接測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Genious6.0 軟件進(jìn)行核苷酸序列比較，核酸序列位置編碼參考美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（NCBI，http://www.ncbi.nih.gov）上GenBank 中野生型cDNA 序列BRCA1（U14680）和BRCA2（U43746）。所檢測到的位點(diǎn)與乳腺癌信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫（Breast Cancer Information Core，BIC）對照，判斷是否為新發(fā)現(xiàn)的突變。不同分組間采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家族性乳腺癌患者資料

共收集54例家族性乳腺癌患者，年齡28～74歲，≤40 歲的13人（24.1%），＞40 歲的41人（75.9%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的19人（35.2%），淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的35人（64.8%）；三陰性乳腺癌7人（13%），非三陰性乳腺癌47人（87%）。

2.1.1BRCA1/2基因突變情況 54例家族性乳腺癌患者中共發(fā)現(xiàn)8例基因突變，其中BRCA1突變患者共6例，分別位于外顯子3、11、15，其中4例（4/6，66.7%）位于外顯子11；BRCA2突變患者共2例，分別位于外顯子11、14（表1）。8例均未在BIC 及其他文獻(xiàn)中報(bào)道，可能為新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。突變類型均為單個(gè)堿基置換突變，其中BRCA1突變中3 外顯子146G＞A 造成天冬氨酸被絲氨酸代替；11 外顯子1019A＞T 造成賴氨酸被異亮氨酸代替，1405C＞T 造成脯氨酸被絲氨酸代替，3551A＞G 造成賴氨酸被精氨酸代替，3295G＞C造成甘氨酸被精氨酸代替；15外顯子4908C＞G 造成絲氨酸被精氨酸代替。BRCA2突變中11 外顯子2317A＞G 造成蘇氨酸被丙氨酸代替，14外顯子7058C＞G造成丙氨酸被甘氨酸代替。

2.1.2BRCA1/2基因突變在不同臨床特征中的表達(dá)情況 54例家族性乳腺癌患者中BRCA1和BRCA2的總突變率為15.8%（8/54）。其中6例位于BRCA1（11.1%，6/54），2例位于BRCA2（3.7%，2/54）。所有家族性乳腺癌患者中≤40 歲的共13人，BRCA1、BRCA2突變率分別為15.4%和7.7%；＞40 歲的共41人，BRCA1、BRCA2突變率分別為21.9%和9.8%。家族中有2人患乳腺癌的患者BRCA1、BRCA2總突變率為10.6%，而有3名或3名以上患乳腺癌的患者總突變率為42.9%。淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者共有4例基因突變，突變率為21.1%。

2.1.3BRCA1/2基因突變與三陰性乳腺癌 三陰性乳腺癌中BRCA1/2基因突變較為常見。本研究免疫組化結(jié)果符合三陰性乳腺癌的患者總突變率為28.6%（2/7），非三陰性乳腺癌患者的總突變率為12.8%（6/47），二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BRCA1突變的患者中2例為三陰性乳腺癌，4例為非三陰性乳腺癌；BRCA2基因突變的患者均為非三陰性乳腺癌（表2）。

表1 54例家族性乳腺癌患者BRCA1/2突變

2.2 健康遺傳性高危人群中BRCA1/2突變

24例健康遺傳性高危人群中共發(fā)現(xiàn)2例致病性突變，均位于BRCA1的11 外顯子，突變率為8.3%（2/24）。突變類型為堿基置換突變，2417T＞C 造成異亮氨酸被蘇氨酸代替，2618C＞T 造成脯氨酸被亮氨酸替換（表3）。BRCA2未發(fā)現(xiàn)基因突變。

表2 BRCA1/2基因突變與三陰性乳腺癌

表3 遺傳性高危人群BRCA1/2突變

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是由多因素影響共同產(chǎn)生的結(jié)果，遺傳因素是其中很重要的一個(gè)方面。家族性乳腺癌是指具有家族聚集性的乳腺癌，占所有乳腺癌的5%～10%。家族性乳腺癌中50%～60%具有明確的遺傳因素（如基因突變）。

乳腺癌易感基因BRCA1[1]、BRCA2[2]自20 世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)以來，對其研究逐漸深入。BRCA1/2作為腫瘤抑制基因，在維護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目穩(wěn)定方面具有重要作用。當(dāng)基因突變發(fā)生后，通過改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)促使染色體不穩(wěn)定從而失活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。目前BRCA1/2突變檢查已納入乳腺癌NCCN指南、ESMO 指南和NCCN 乳腺癌降低風(fēng)險(xiǎn)指南，用于常規(guī)指導(dǎo)家族性乳腺癌的篩查、預(yù)防與治療。

國外研究顯示，毆裔人群中家族性乳腺癌占全部乳腺癌的5%～10%，BRCA1基因突變率可高達(dá)45%[6]，在乳腺癌與卵巢癌均高發(fā)的家族中BRCA1突變率可高達(dá)90%[7]。在歐裔健康人群中，BRCA1/2基因突變率可以高達(dá)30%左右，是遺傳性乳腺癌發(fā)病的極高危因素[8]。BRCA1/2基因突變攜帶者患乳癌的風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)40%～85%[9-10]。Brohet等[11]針對582例BRCA1和176例BRCA2突變的家族進(jìn)行的患病風(fēng)險(xiǎn)研究發(fā)現(xiàn)，截至70 歲，BRCA1突變?nèi)巳夯既橄侔┑娘L(fēng)險(xiǎn)是45%，BRCA2突變?yōu)?7%，突變位點(diǎn)和家族遺傳強(qiáng)弱與患癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

國內(nèi)現(xiàn)有家族性乳腺癌相關(guān)研究樣本量普遍偏小[12-13]，BRCA1/2基因突變率約為10%。已報(bào)道的家系乳腺癌最大樣本量的研究為北京腫瘤醫(yī)院張娟[14]等對北方地區(qū)409例家族性乳腺癌患者進(jìn)行的BRCA1/2基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)BRCA1/BRCA2突變率為10.5%。乳腺癌患者BRCA1/2基因突變存在明顯的種族、地區(qū)差異[15]。BRCA1/2可發(fā)生多形式、多位點(diǎn)的基因突變，突變可分布于整個(gè)編碼區(qū)域，突變形式大多為移碼、缺失或插入。這種形式的基因突變引起乳腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)度可達(dá)80%～90%，另存在小部分的堿基置換突變，各種突變形式共同導(dǎo)致同義突變、錯(cuò)義突變和無義突變的結(jié)果。BRCA1/2基因突變位點(diǎn)眾多，種類復(fù)雜，每個(gè)種族和地區(qū)有其自己的突變特征和規(guī)律。綜上對國內(nèi)現(xiàn)有的BRCA1/2基因突變的研究發(fā)現(xiàn)：約50%的突變位點(diǎn)為中國人所特有，與白種人的突變位點(diǎn)不一致；與白種人相比，突變檢出率普遍偏低。

BRCA1/2是與家族性或遺傳性乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，在乳腺癌健康遺傳性高危人群中，BRCA1/2基因突變被視為須進(jìn)行預(yù)防干預(yù)的極高危因素，但BRCA1/2基因在中國漢族健康遺傳性高危人群中的研究基本空白，截至目前，國內(nèi)針對健康遺傳性高危人群僅見河北對家系健康成員的小樣本研究[16]。來自香港的Kwong 等[17]首次對69例乳腺癌遺傳性高危人群進(jìn)行1 年隨訪，發(fā)現(xiàn)基因突變檢測的人群定期復(fù)查率比未檢測前明顯增高，但僅有個(gè)別人選擇預(yù)防性手術(shù)切除，大多數(shù)還是選擇中藥進(jìn)行預(yù)防。除香港外，國內(nèi)未見任何遺傳性高危人群發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防干預(yù)的報(bào)道。目前國內(nèi)對于健康遺傳性高危人群BRCA1/2基因突變檢測并未出現(xiàn)大樣本量的研究，更沒有關(guān)于健康遺傳性高危人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究，因而對于健康遺傳性高危人群BRCA1/2突變的基本特征不明了，對其未來發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的情況也無法評估。

因此，本研究共收集54名家族性乳腺癌患者外周血并提取基因組DNA，應(yīng)用PCR-DNA 直接測序技術(shù)對BRCA1/2編碼外顯子進(jìn)行直接測序，共發(fā)現(xiàn)8例致病性突變，總突變率為14.8%，其中BRCA1和BRCA2突變頻率分別為11.1%和3.7%，BRCA1突變是BRCA2突變頻率的3 倍（11.1% vs 3.7%）。以上結(jié)果略高于國內(nèi)報(bào)道水平。這可能由于國內(nèi)的大多數(shù)研究是基于歐美人群的突變高發(fā)區(qū)域展開的熱點(diǎn)測序，在中國人BRCA1/2突變規(guī)律尚未明確的前提下可能會對熱點(diǎn)突變區(qū)域有所遺漏。另外，國內(nèi)既往報(bào)道中采用的突變檢測方法多為PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性）或PCR-DHPLC（denaturing high performance liquid chromatography，變性高效液相色譜分析）技術(shù)，技術(shù)自身的限制性及BRCA1/2基因突變的復(fù)雜性導(dǎo)致一部分突變不能被發(fā)現(xiàn)，從而造成漏檢。本研究使用一代DNA 直接測序技術(shù)（金標(biāo)準(zhǔn)），不僅可以準(zhǔn)確測定基因組片段中存在的所有突變，并能夠覆蓋全部編碼外顯子，所以檢測的基因突變率可能會有所提高。本研究中發(fā)現(xiàn)的突變類型均為堿基置換突變，但國內(nèi)外研究報(bào)道BRCA1/2基因突變多為移碼突變，其他突變類型雖存在但與移碼突變相比較少。這可能與檢測方法及BRCA1/2突變本身數(shù)目龐大、類型多樣、具有地域差異等因素相關(guān)。三陰性乳腺癌在乳腺癌中所占的比例為15%～20%[18]，是一類雌、孕激素受體及人表皮生長因子受體-2 均表達(dá)陰性的乳腺癌。研究顯示[19]，BRCA1/2基因突變在三陰性乳腺癌中較為常見。本研究入組患者中共7例三陰性乳腺癌，BRCA1/2基因總突變率為28.6%，非三陰性乳腺癌患者的總突變率為12.8%。三陰性乳腺癌患者的突變率是非三陰性乳腺癌患者的2.2倍，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國內(nèi)外研究基本一致。

另外，BRCA1/2突變檢測對于健康遺傳性高危人群的早期預(yù)防和預(yù)測發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義，然而國內(nèi)相關(guān)研究卻十分罕見。基于此研究的重要性，我們收集24例健康遺傳性高危人群，對其BRCA1/2全編碼外顯子進(jìn)行DNA 直接測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例致病性突變，突變位點(diǎn)均位于BRCA1，突變率為8.3%，低于國外研究結(jié)果[8]，可能與樣本量較少、種族差異等原因有關(guān)。在健康遺傳性高危人群中發(fā)現(xiàn)BRCA1/2基因突變，意味著今后對該人群值得進(jìn)行更大樣本量的BRCA1/2突變檢測，以期能夠評估健康高危人群BRCA1/2攜帶者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，我們不僅對中國漢族家族性乳腺癌患者進(jìn)行了BRCA1/2基因突變檢測，進(jìn)一步了解家族性乳腺癌中BRCA1/2基因突變情況，更重要的是彌補(bǔ)了對健康遺傳性高危人群BRCA1/2基因突變檢測的空白，對中國健康高危人群乳腺癌的預(yù)防及風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義。

[1]Hall J M,Lee M K,Newman B,et al.Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21[J].Science,1990,250(4988):1684-1689.

[2]Wooster R,Neuhausen S L,Mangion J,et al.Localization of a breast cancer susceptibility gene,BRCA2,to chromosome 13q12-13[J].Science,1994,265(5181):2088-2090.

[3]Morris J R,Boutell C,Keppler M,et al.The SUMO modification pathway is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress[J].Nature,2009,462(7275):886-890.

[4]De Siervi A,De Luca P,Byun J S,et al.Transcriptional autoregulation by BRCA1[J].Cancer Res,2010,70(2):532-542.

[5]Venkitaraman A R.Cancer suppression by the chromosome custodians,BRCA1 and BRCA2[J].Science,2014,343(6178):1470-1475.

[6]Hall M J,Reid J E,Burbidge L A,et al.BRCA1 and BRCA2 mutations in women of different ethnicities undergoing testing for hereditary breast-ovarian cancer[J].Cancer,2009,115(10):2222-2233.

[7]Hall M J,Reid J E,Burbidge L A,et al.BRCA1 and BRCA2 mutations in women of different ethnicities undergoing testing for hereditary breast-ovarian cancer[J].Cancer,2009,115(10):2222-2233.

[8]Konstantopoulou I,Tsitlaidou M,Fostira F,et al.High prevalence of BRCA1 founder mutations in Greek breast/ovarian families[J].Clin Genet,2014,85(1):36-42.

[9]Wang F,Fang Q,Ge Z,et al.Common BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families:a meta-analysis from systematic review[J].Mol Biol Rep,2012,39(3):2109-2118.

[10]Roy R,Chun J,Powell S N.BRCA1 and BRCA2:different roles in a common pathway of genome protection[J].Nat Rev Cancer,2012,12(1):68-78.

[11]Brohet R M,Velthuizen M E,Hogervorst F B,et al.Breast and ovarian cancer risks in a large series of clinically ascertained families with a high proportion of BRCA1 and BRCA2 Dutch founder mutations[J].J Med Genet,2014,51(2):98-107.

[12]Rao Nan-Ya,Zhou Jie,Zhao Lin,et al.BRCA1 and BRCA2 deleterious mutation in 219 Han Chinese hereditary breast cancer patients[J].China Oncol,2008,18(5):370-375.

[13]宋傳貴,胡震,袁文濤,等.中國上海家族性乳腺癌BRCA1和BRCA2基因的突變[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)志,2006,23(1):27-31.

[14]Zhang J,Pei R,Pang Z.Prevalence and characterization of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Chinese women with familial breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2012,132(2):421-428.

[15]Cao W,Wang X,Li J C.Hereditary breast cancer in the Han Chinese population[J].J Epidemiol,2013,23(2):75-84.

[16]李軍改,回天立,李崢,等.家族性乳腺癌家系成員乳腺癌易感基因突變的研究[J].中華乳腺病雜志（電子版）,2012,6(6):631-639.

[17]Kwong A,Chu A T,Wu C T,et al.Attitudes and compliance of clinical management after genetic testing for hereditary breast and ovarian cancer among high-risk Southern Chinese females with breast cancer history[J].Fam Cancer,2014,13(3):423-430.

[18]Yao-Lung K,Dar-Ren C,Tsai-Wang C.Clinicopathological features of triple-negative breast cancer in Taiwanese women[J].Int J Clin Oncol,2011,16(5):500-505.

[19]Anders C K,Zagar T M,Carey L A.The management of early-stage and metastatic triple-negative breast cancer:a review[J].Hematol Oncol Clin North Am,2013,27(4):737-749.puffer fish(Takifugu rubripes)[J].Food Chem,2002,78(2):173-177.