孫琰，劉超，毛赟赟，王璽

1.天津醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌不受病毒侵害。細(xì)菌被病毒侵染后，CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）位點(diǎn)會(huì)編碼多個(gè)核酸酶和解旋酶，形成Cas 蛋白復(fù)合物，對(duì)入侵的病毒DNA 進(jìn)行切割，產(chǎn)生的新片段會(huì)整合到CRISPR重復(fù)序列中，從而對(duì)該病毒產(chǎn)生特異性免疫記憶[1-2]。當(dāng)細(xì)菌再次遭到該病毒入侵時(shí)，便會(huì)轉(zhuǎn)錄出與入侵病毒DNA 序列相匹配的小分子RNA，Cas 蛋白復(fù)合物利用這些RNA 去切割外源病毒DNA，導(dǎo)致病毒不能在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌的這種免疫防御機(jī)制而改造的一種基因組編輯技術(shù)[3]，利用人工設(shè)計(jì)的單向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)外源Cas9 蛋白與靶基因結(jié)合，切割帶有5'-NGG 的間隔相鄰基序（protospacer adjacent motifs，PAM），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因DNA的特異性切割[4]。

表觀遺傳在癌癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用，染色質(zhì)重塑是表觀遺傳的重要機(jī)制之一，染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過(guò)水解ATP 產(chǎn)生的能量來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。染色質(zhì)重塑復(fù)合物是較大的多亞基復(fù)合物，已知有SWI/SNF、ISWI、CHD 和IN080四大類(lèi)。其中SWI/SNF是目前研究最多的，SNF5是SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心組分之一，高度保守。研究發(fā)現(xiàn)SNF5是一個(gè)強(qiáng)抑癌基因，在許多惡性腫瘤中突變或缺失，如橫紋肌樣瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤、乳腺癌、上皮樣肉瘤及其他軟組織的惡性腫瘤等[5-12]。目前有關(guān)SNF5的抗腫瘤機(jī)制研究不多。我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)SNF5基因的sgRNA，構(gòu)建了SNF5基因的CRISPR/Cas9n 表達(dá)載體，旨在通過(guò)敲除SNF5基因?yàn)樯钊胙芯縎NF5的抗腫瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、pX461 和pX462 質(zhì)粒（本研究室保存）；BbsⅠ、磷酸酯酶（Fermentas 公司）；T4DNA 連接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB公司）；膠回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公 司）；胎牛血 清（PAN 公 司）；LipofectAMINE 2000（Invitrogen 公 司）；抗SNF5 抗 體（Abcam 公司）；β-actin 抗體、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司）。

1.2 sgRNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)

應(yīng)用CRISPR 在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/），在人源SNF5基因外顯子1 處設(shè)計(jì)了一對(duì)sgRNA。設(shè)計(jì)過(guò)程如下：①?gòu)腟NF5基因起始密碼子處開(kāi)始尋找長(zhǎng)度約200 bp、富含NGG且位于同一外顯子上的序列，將序列提交至該網(wǎng)站；②根據(jù)提交后網(wǎng)站顯示的結(jié)果，選擇分?jǐn)?shù)較高的一對(duì)序列，自動(dòng)生成的靶序列都是5'到3'共23 bp；③去掉序列3'端的NGG，并在5'端加上酶切位點(diǎn)CACC，其反向互補(bǔ)序列的5'端添加酶切位點(diǎn)AAAC，以便2條互補(bǔ)的寡核苷酸序列退火后，能夠與經(jīng)BbsⅠ酶切的質(zhì)粒的粘性末端互補(bǔ)；如果靶序列5'端第一個(gè)堿基不是G，那么應(yīng)先在5'端添加一個(gè)G，再加上酶切位點(diǎn)CACC，相應(yīng)地其反向互補(bǔ)序列的3'端再增加一個(gè)C。

1.3 SNF5sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

首先用T4多聚核苷酸激酶對(duì)合成的2組引物分別進(jìn)行磷酸化和退火，退火后的sgRNA 分別插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pSpCas9n（BB）-2A-GFP（簡(jiǎn)稱(chēng)pX461）和pSpCas9n（BB）-2A-Puro（簡(jiǎn)稱(chēng)pX462）中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定（由北京六合華大基因科技股份有限公司完成），測(cè)序引物為5'-ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3'。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于12 孔板，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到90%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照LipofectAMINE 2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Westen印跡分析

轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后24～48 h 收集細(xì)胞，加入SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE；電泳完畢轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的SNF5 抗體，4℃過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次7 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min；顯色后壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶點(diǎn)及寡核苷酸序列設(shè)計(jì)

將選擇的人源SNF5基因序列在線(xiàn)提交上述網(wǎng)站后，在外顯子1 處設(shè)計(jì)了一對(duì)sgRNA（圖1），網(wǎng)站生成的序列為5'-GACGGCGAGTTCTACATGATCG G-3'和5'-CTTCACGGGCTTCTGCCCGAAGG-3'。根據(jù)生成的靶序列，設(shè)計(jì)了4 條寡核苷酸序列（表1）。將合成的2 組寡核苷酸序列分別退火，退火后插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pX461和pX462，構(gòu)建的表達(dá)載體分別為pX461-hSNF5sgRNA1、pX461-hSNF5sgRNA2、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2。

2.2 SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建的測(cè)序結(jié)果

將構(gòu)建的4 個(gè)表達(dá)載體分別測(cè)序，結(jié)果顯示sgRNA 靶序列均正確插入pX461 和pX462，證明SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 sgRNA對(duì)SNF5表達(dá)的影響

表1 合成的寡核苷酸序列

圖1 一對(duì)靶向SNF5第1個(gè)外顯子的sgRNA

將pX461、pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2、pX462、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24、48 h 收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western 印跡。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pX461 空載體組比，轉(zhuǎn)染pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2 后24 h，SNF5表達(dá)水平明顯降低，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5表達(dá)水平開(kāi)始恢復(fù)；與轉(zhuǎn)染pX462 空載體組比，轉(zhuǎn)染pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 后24 h，SNF5 表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5 表達(dá)水平顯著降低（圖3）。此現(xiàn)象表明，不同標(biāo)簽載體表達(dá)的sgRNA 起效時(shí)間并不一致，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行摸索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們構(gòu)建的針對(duì)人源SNF5基因的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)能夠敲除細(xì)胞中SNF5基因的表達(dá)。

3 討論

Cas9 核酸內(nèi)切酶有HNH 和RuvC 兩個(gè)活性位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?；蚪MDNA通過(guò)啟動(dòng)同源重組和非同源末端連接機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，可能產(chǎn)生基因突變、插入或缺失[13]。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA 配對(duì)且靠近PAM 處的7～12 個(gè)堿基有關(guān)，因此CRISPR/Cas9 的靶向特異性非常低[14]，會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性及工作量的大量增加，這種脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致基因組中癌基因激活、其他序列突變等不良后果，給臨床應(yīng)用帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。張峰課題組將Cas9 的RuvC 催化位點(diǎn)進(jìn)行突變，形成產(chǎn)生單鏈切口的核酸酶Cas9 nickase（Cas9n），通過(guò)一對(duì)sgRNA 引導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向雙鏈切割，此方法能顯著降低（約1/50～1/1500）CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)[15]。

本研究采用的即為上述CRISPR-Cas9n系統(tǒng)，本系統(tǒng)所用質(zhì)粒是CRISPR 與Cas9n 的共質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，可以提高基因敲除效率。在設(shè)計(jì)sgRNA 靶序列時(shí)應(yīng)注意：靶序列應(yīng)位于基因同一個(gè)外顯子內(nèi)，不能在外顯子與內(nèi)含子交界處，且靶序列應(yīng)位于基因的CDS 區(qū)；如果外顯子內(nèi)CDS 序列少于60 bp，則沒(méi)必要再進(jìn)行設(shè)計(jì)，即使設(shè)計(jì)了效果也不佳；選擇的靶序列離ATG 越近越好。在線(xiàn)提交所選基因序列后，得出的評(píng)分結(jié)果是針對(duì)脫靶效應(yīng)的，分值越高脫靶效應(yīng)越小。

圖2 構(gòu)建的SNF5sgRNA表達(dá)載體測(cè)序峰圖

圖3 Westren印跡檢測(cè)SNF5蛋白表達(dá)水平

我們發(fā)現(xiàn)，293T 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入SNF5sgRNA 后，與轉(zhuǎn)染空載體組比，SNF5 表達(dá)水平顯著降低。這種SNF5表達(dá)水平改變反映的是SNF5在細(xì)胞群體水平敲除后的變化，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)切割基因組DNA后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)同源重組和非同源末端連接機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，這些修復(fù)是隨機(jī)的，不同細(xì)胞個(gè)體突變修復(fù)后的基因型各不相同。本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了表達(dá)綠色熒光蛋白的pX461和表達(dá)嘌呤霉素的pX462兩種載體，可以借助綠色熒光蛋白進(jìn)行流式分選或借助嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的聚集，便于通過(guò)有限稀釋法獲取SNF5基因穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞，通過(guò)測(cè)序即可得到基因型確定的敲除細(xì)胞株。

研究發(fā)現(xiàn)，SNF5基因的缺失是非典型畸胎瘤、橫紋肌樣瘤、黑色素瘤患者診斷的一個(gè)很好的標(biāo)記物[16-18]。Roberts 等發(fā)現(xiàn)，SNF5條件性失活小鼠在平均11周內(nèi)發(fā)生T細(xì)胞淋巴瘤，明顯快于p53、RB等重要腫瘤抑制基因[19]。然而SNF5突變后如何導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，如何影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而如何導(dǎo)致癌癥的具體機(jī)制在很大程度上仍然不清楚。

綜上，我們利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立了SNF5基因靶向敲除系統(tǒng)，通過(guò)敲除細(xì)胞株中SNF5基因，為研究其在疾病中的功能和具體作用機(jī)制提供了很好的工具。

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