丁立，熊麗娟，王欲曉，吳成林，付凱飛，周麗君

1.南方醫(yī)科大學(xué) 第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.海軍總醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)科，北京 100048

FK506結(jié)合蛋白52（FK506 binding protein 52，F(xiàn)KBP52）屬于免疫抑制劑FK506 結(jié)合蛋白（FKBP）家族，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，也有一部分存在于胞質(zhì)中。FKBP52由459個(gè)氨基酸殘基組成，其編碼基因FKBP4定位于染色體12p13.33，全長(zhǎng)10 482 bp。已知FKBP52 在調(diào)控甾體激素受體信號(hào)通路及中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元微管功能中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)FKBP52 與多種癌癥、生殖與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如在前列腺癌（雄激素相關(guān)）病人前列腺穿刺活檢中可檢測(cè)到高表達(dá)的FKBP52，在反復(fù)自然流產(chǎn)病人（孕激素相關(guān)）中FKBP52蛋白表達(dá)水平則顯著降低；基因敲除實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)FKBP52可與病理性Tau蛋白相互作用介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)退行性變[2]。值得一提的是，F(xiàn)KBP52 的小分子配體已被認(rèn)為是潛在的營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)藥物[3]。以上均提示FKBP52或可成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)[4]。因此，我們擬運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，通過自行構(gòu)建的大容量噬菌體抗體庫(kù)，以FKBP52為抗原，篩選特異性人源抗FKBP52單戀抗體（scFv），并進(jìn)一步通過同源重組技術(shù)構(gòu)建完整抗體的真核表達(dá)載體，為實(shí)現(xiàn)抗FKBP52人源抗體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌XL-1Blue、HB2151 菌株，輔助病毒VCSM13 由本實(shí)驗(yàn)室保存；大容量噬菌體抗體庫(kù)及含有輕、重鏈恒定區(qū)的pCMV-L 和pCMV-H 抗體真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；FKBP52 蛋白、親環(huán)素A 由美國(guó)科羅拉多州丹佛大學(xué)卡爾·K·愛德華教授惠贈(zèng)；卵清蛋白（OA）和鐵蛋白（Fer）購(gòu)自Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的抗M13 小鼠單抗購(gòu)自GE 公司；HRP標(biāo)記的抗V5 小鼠單抗購(gòu)自Invitrogen 公司；同源重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自promega 公司；免疫管（Immunotube）購(gòu)自NUNC公司；ELISA板購(gòu)自CORING公司。

1.2 大容量噬菌體抗體工作庫(kù)的制備及抗FKBP52噬菌體抗體的篩選

篩選所用大容量噬菌體抗體工作庫(kù)由本實(shí)驗(yàn)室保存的原始抗體庫(kù)制備，具體實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)[5]?？笷KBP52 人源抗體的篩選采用酸洗脫方法[6]，實(shí)驗(yàn)步驟主要包括：將FKBP52 蛋白用包被液（0.1 mol/L NaHCO335 mL，0.1 mol/L Na2CO315 mL，H2O 50 mL）稀釋至50 μg/mL，包被免疫管，4℃過夜后用5%的脫脂奶粉37℃封閉3 h，加入1 mL 制備好的噬菌體抗體庫(kù)，37℃孵育3 h，用含1‰ Tween 的PBS 洗15 次，加入1 mL 甘氨酸鹽酸（pH2.2）洗脫（37℃10 min），Tris 堿中和后加入1 mL XL-1Blue，37℃、15 min，轉(zhuǎn)入錐形瓶并取10 μL鋪含氨芐西林（Amp）的培養(yǎng)盤測(cè)定菌落形成單位（CFU），錐形瓶于37℃搖床培養(yǎng)約1 h 后補(bǔ)足含Amp 的SB 培養(yǎng)基至100 mL，37℃、200 r/min 培養(yǎng)5 h 后加入VCSM13，30℃培養(yǎng)過夜，次日離心收集上清，PEG、NaCl 沉淀后得級(jí)次噬菌體抗體庫(kù)，加入免疫管進(jìn)行第2輪篩選，如是篩選4 輪。計(jì)算每輪獲得的噬菌體抗體庫(kù)的滴度，通過計(jì)算每輪抗體庫(kù)投入和產(chǎn)出比（富集率），評(píng)價(jià)抗FKBP52噬菌體抗體的篩選是否有富集。

1.3 噬菌體抗體的篩選及特異性鑒定

分別從第3、4輪篩選的含Amp的培養(yǎng)盤中隨機(jī)挑取單克隆，置于含Amp 的LB 培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入VCSM13 誘導(dǎo)感染，30℃培養(yǎng)過夜后離心取上清即得到噬菌體抗體。

噬菌體抗體特異性鑒定采用ELISA 方法：稀釋FKBP52 抗原至5 μg/mL，50 μl/孔包被ELISA 板，4℃過夜，用5%脫脂奶粉于37℃封閉3 h后加入噬菌體抗體，37℃孵育2 h，用含1‰ Tween 的PBS 洗后加入二抗（HRP 抗M13 小鼠單抗），37℃孵育2 h，洗滌后加入TMB底物顯色液顯色，用酶標(biāo)儀讀取D450nm值，根據(jù)讀數(shù)選出陽(yáng)性克隆，再以O(shè)A、Fer 為抗原包被ELISA板，以測(cè)定噬菌體抗體的特異性。

1.4 噬菌體抗體可變區(qū)基因DNA序列測(cè)定

挑選出經(jīng)上述步驟篩選到的特異性陽(yáng)性克隆送諾賽公司測(cè)序，運(yùn)用相關(guān)軟件對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析。

1.5 抗FKBP52-scFv的可溶性表達(dá)及檢測(cè)

將序列分析后基因型不同的噬菌體抗體按照文獻(xiàn)[7]所述步驟感染新鮮培養(yǎng)的HB2151 菌后，挑選單克隆于37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（1 mmol/L）于30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜后離心收取上清，獲得可溶性FKBP52-scFv。采用ELISA 方法對(duì)對(duì)可溶性抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)，無(wú)關(guān)抗原除OA、Fer 外增加親環(huán)素A。實(shí)驗(yàn)中一抗為可溶性上清，二抗為HRP 抗V5小鼠單抗（針對(duì)載體上含有的14個(gè)氨基酸殘基的V5標(biāo)簽：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr），其余步驟同噬菌體抗體特異性測(cè)定。

1.6 抗體的親和力測(cè)定

抗體-抗原親和力檢測(cè)采用生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）法[8]，由北京拓普百奧科技公司用ForteBio公司的RED96型生物分子相互作用儀進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線采用FortebBio 數(shù)據(jù)分析軟件以1∶1 模型擬合獲取結(jié)合常數(shù)（Kon）、解離常數(shù)（Kd）和親和常數(shù)（KD）。

1.7 完整抗體輕、重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.7.1 完整輕、重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用同源重組的方法[9]。根據(jù)篩選獲得的scFv 輕、重鏈可變區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)上、下游引物，PCR 分別擴(kuò)增輕、重鏈可變區(qū)基因，用同源重組試劑盒分別與輕、重鏈真核表達(dá)載體pCMV-L 和pCMV-H 進(jìn)行同源重組，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，鋪卡那霉素（Kan）抗性盤，37℃孵育過夜，獲得完整抗體真核表達(dá)載體。

1.7.2 完整輕、重鏈真核表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆的鑒定 采用常規(guī)菌液PCR 方法，隨機(jī)挑選Kan 盤上單克隆菌為模板，擴(kuò)增可變區(qū)及完整抗體片段，選擇經(jīng)PCR方法鑒定為陽(yáng)性的克隆送諾賽公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)際工作庫(kù)的制備

用原始庫(kù)超感染BS1365 菌后得到的次級(jí)庫(kù)滴度為1.26×1013，再用其感染對(duì)數(shù)期XL-1Blue菌后得到的工作庫(kù)滴度為5.0×1014，用于下步抗體篩選。

2.2 抗FKBP52噬菌體抗體的篩選及鑒定

經(jīng)4輪篩選，抗FKBP52噬菌體抗體的回收率達(dá)千倍富集（表1），分別從3、4輪隨機(jī)挑選500個(gè)克隆制備噬菌體抗體，ELISA結(jié)果表明其中126個(gè)克隆可與FKBP52 結(jié)合，進(jìn)一步的特異性測(cè)定表明其中45個(gè)克隆與OA、Fer蛋白等無(wú)關(guān)抗原不結(jié)合，其特異性克隆占35%。

2.3 噬菌體抗體可變區(qū)基因DNA 序列分析及可溶性表達(dá)

對(duì)獲得的特異性克隆測(cè)序后對(duì)可變區(qū)DNA 進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)46個(gè)陽(yáng)性克隆具有15種不同基因型。將15種陽(yáng)性噬菌體抗體上清感染HB2151菌獲得可溶性表達(dá)，進(jìn)一步進(jìn)行特異性測(cè)定，其中7種獲得可溶性表達(dá)（圖1）。對(duì)這7 種單鏈抗體可變區(qū)進(jìn)行分析，其輕鏈可變區(qū)分屬VκⅠ、VκⅢ、VλⅠ亞群，而重鏈可變區(qū)則分屬VHⅠ、VHⅢ、VHⅣ亞群。

2.4 噬菌抗體的親和力測(cè)定

從7種可溶性表達(dá)活性較高的陽(yáng)性克隆中挑選4種進(jìn)行親和力測(cè)定，結(jié)果見表2。

2.5 完整輕重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

選擇親和力較好的克隆3，用同源重組方法分別構(gòu)建輕、重鏈真核表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化，各挑取10個(gè)克隆PCR鑒定，其中輕、重鏈陽(yáng)性克隆分別為9和10個(gè)，陽(yáng)性率分別為90%和100%；進(jìn)一步挑選2 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示全部正確，圖2為其中一個(gè)陽(yáng)性克隆的PCR鑒定結(jié)果。說明已構(gòu)建成表達(dá)完整輕、重鏈的真核表達(dá)載體。

表1 抗FKBP52噬菌體抗體篩選各輪回收率

圖1 可溶性抗體的特異性檢測(cè)

3 討論

FKBP52 因其特征性的對(duì)甾體激素受體及中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元微管的調(diào)控功能而被證實(shí)與多種疾病存在關(guān)聯(lián)。最新研究發(fā)現(xiàn)，其在前列腺癌、乳腺癌、肝癌中均有著顯著的高表達(dá)[10-11]，而在反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）、先兆子癇（PE）及胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限（IUGR）等生殖疾病中亦有著明顯異常的表達(dá)[12-13]。另外，其還在一定程度上介導(dǎo)Tau蛋白病的發(fā)生，且被認(rèn)為參與了花青素潛在預(yù)防阿爾茲海默?。ˋD）的作用機(jī)制[14]。種種研究均表明FKBP52 可作為前列腺癌、乳腺癌、肝癌的早期診斷標(biāo)志，且有望成為上述癌癥及生殖相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。此外，對(duì)FKBP52 表達(dá)水平早期測(cè)定有助于預(yù)測(cè)AD 的發(fā)生，而針對(duì)提高FKBP52 活性的藥物還可能成為預(yù)防及治療AD的有效手段[15]。故研制針對(duì)FKBP52的人源化抗體有著非常實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展前景，同時(shí)也有助于更好地深入評(píng)價(jià)其功能。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是起源于上世紀(jì)90 年代的一種人源抗體制備技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，在早期針對(duì)新型治療靶點(diǎn)人源抗體的制備及評(píng)價(jià)方面有良好的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步探討FKBP52作為自身免疫性疾病治療靶點(diǎn)的潛質(zhì)，我們使用本室自行構(gòu)建的大容量噬菌體scFv抗體庫(kù)，通過吸附、擴(kuò)增、洗脫過程篩選抗FKBP52 的噬菌體抗體，經(jīng)ELISA測(cè)定、DNA序列分析，獲得了多株具有不同基因型的抗FKBP52 人源scFv?；谝酝芯拷?jīng)驗(yàn)，為了避免噬菌體抗體基因Ⅲ蛋白對(duì)scFv結(jié)構(gòu)的影響造成的假陽(yáng)性，我們進(jìn)一步對(duì)獲得的噬菌體抗體進(jìn)行了可溶性表達(dá)，最終獲得了7 株基因型不同的特異性抗體。同時(shí)，我們挑選特異性結(jié)合活性高的4株進(jìn)行了親和力測(cè)定，結(jié)果顯示親和力均在10-8范圍內(nèi)，尚未達(dá)到可用的10-9，符合噬菌體抗體篩選的普遍特性，可能與scFv同抗原結(jié)合單價(jià)相關(guān)，有待表達(dá)完整抗體后再進(jìn)行親和力測(cè)定，相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

表2 不同克隆的親和力測(cè)定

圖2 完整抗體輕、重鏈表達(dá)載體的PCR測(cè)定

噬菌體抗體技術(shù)作為一種成熟的工程抗體制備技術(shù)，已被廣泛用于特異性抗體片段的制備中，但由于制備的僅是抗體功能片段，半衰期短，加上多為原核表達(dá)載體，抗體片段蛋白沒有經(jīng)過蛋白翻譯后修飾，很難滿足治療性抗體需要，因此必須將篩選獲得的抗體片段轉(zhuǎn)換為真核表達(dá)的完整抗體分子。以往進(jìn)行真核表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)多采用酶切的方法，但往往耗時(shí)長(zhǎng)、連接效率不高。在本研究中，我們選擇親和力較好的一株scFv，采用同源重組方法進(jìn)行了完整抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建，并通過了PCR 驗(yàn)證及測(cè)序確證。重組方法操作簡(jiǎn)便、快速且成功率高，為將抗體庫(kù)篩選獲得的小分子抗體轉(zhuǎn)換為完整抗體提供了新方法。目前我們已在HEK293-F細(xì)胞中表達(dá)了完整抗FKBP52 人源抗體，正在對(duì)獲得的抗體進(jìn)行分離純化及功能測(cè)定，結(jié)果將后續(xù)報(bào)道。

[1]Cioffi D L,Hubler T R,Scammell J G.Organization and function of the FKBP52 and FKBP51 genes[J].Curr Opin Pharmacol,2011,11(4):308-313.

[2]Giustiniani J,Chambraud B,Sardin E,et al.Immunophilin FKBP52 induces Tau-P301L filamentous assembly in vitro and modulates its activity in a model of tauopathy[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(12):4584-4589.

[3]Utuk A,Sarikcioglu L,Demirel B M,et al.The immunosup-pressive agent FK506 prevents subperineurial degeneration and demyelination on ultrastructural and functional analysis[J].Curr Neurovasc Res,2009,6(4):252-258.

[4]Storer C L,Dickey C A,Galigniana M D,et al.FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease[J].Trends Endocrinol Metab,2011,22(12):481-490.

[5]喬媛媛,王琰,陳曉穗,等.大容量噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(3):194-197.

[6]秦海艷,王建鋒,熊穎,等.鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及篩選[J].生物技術(shù)通訊,2015,26(1):59-63.

[7]劉啟剛,代云見,張勇俠,等.抗IgE單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性高效表達(dá)條件的研究[J].中國(guó)生物工程雜志,2012,32(11):23-28.

[8]張晟,羅弟祥,劉怡,等.抗體含量檢測(cè)的生物膜干涉技術(shù)、HPLC及ELISA的比較[C].2012年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國(guó)藥師周,南京,2012.

[9]Zu Y,Tong X,Wang Z,et al.TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish[J].Nat Methods,2013,10(4):329-331.

[10]Sivils J C,Storer C L,Galigniana M D,et al.Regulation of steroid hormone receptor function by the 52-kDa FK506-binding protein(FKBP52)[J].Curr Opin Pharmacol,2011,11(4):314-319.

[11]李傳偉,王雪迪,張智,等.FKBP12 和FKBP52 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)癌癥防治雜志,2014,(2):138-142.

[12]Chen H Y,Li O Y,Pang L H,et al.Expression of FK506-binding protein 52(FKBP52) in chorionic villi with early recurrent spontaneous abortion[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2015,28(10):1165-1169.

[13]Acar N,Ustunel I.Expression of 52-kDa FK506-binding protein(FKBP52) in human placenta complicated by preeclampsia and intrauterine growth restriction[J].Anal Quant Cytopathol Histpathol,2015,37(2):87-95.

[14]Hung T C,Chang T T,Fan M J,et al.In silico insight into potent of anthocyanin regulation of FKBP52 to prevent Alzheimer's disease[J].Evid Based Complement Alternat Med,2014,2014:450592.

[15]Giustiniani J,Sineus M,Sardin E,et al.Decrease of the immunophilin FKBP52 accumulation in human brains of Alzheimer's disease and FTDP-17[J].J Alzheimers Dis,2012,29(2):471-483.