南雪 ，單紫筠，張迦南，賈茜媛，龍冬瑩，岳文，裴雪濤

1.軍事醫(yī)學科學院 野戰(zhàn)輸血研究所干細胞與再生醫(yī)學研究室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學科學院 華南干細胞與再生醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510005

膠原蛋白是白色、不透明、無支鏈的三螺旋纖維蛋白質，是結締組織極其重要的結構蛋白質，起著支撐器官、保護機體的作用[1]。膠原蛋白可作為表皮細胞的遷移、增殖支架，促進皮膚細胞的增生修復和愈合[2]；可促進骨的形成，增強低鈣水平下的骨膠原結構[3-4]；還可吸附腸道中的毒素和重金屬，降低血清甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）[5-6]等。隨著干細胞與組織工程領域的飛速發(fā)展，膠原蛋白因其良好的組織相容性、較高的孔隙率以及可生物降解等多項優(yōu)勢，越來越多地被應用于組織工程皮膚、骨、軟骨、心臟瓣膜等的構建[7-11]。

目前，膠原蛋白制品主要是從陸生脊椎動物如牛、豬、雞等的皮膚、軟骨、肌腱中提取。然而，近年來，由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等動物傳染性疾病全球肆虐，再加上部分國家與民族的宗教和習俗限制，人們開始尋求從低等脊椎動物和無脊椎動物中提取膠原蛋白[12-14]。研究表明，蛙皮中含有豐富的膠原蛋白，可作為膠原蛋白的一種潛在來源[3,6,15]。中國林蛙（Rana chensinensis）是林蛙油的主要提取原料，從廢棄的林蛙皮中提取膠原蛋白，可以在充分利用廢棄生物資源的同時開發(fā)出高附加值的產(chǎn)品，用于生物醫(yī)藥領域，具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。我們采用低溫酸酶法結合提取林蛙皮膠原蛋白，在提高膠原蛋白提取率的情況下盡可能地保持所提取膠原蛋白的生物活性，并對其生物學特性進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

林蛙皮粉（安圖東北亞生物制品有限公司）；胃蛋白酶（≥250 U/mg，Sigma-Aldrich 公司）；TRIS、丙烯酰胺、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、TEMED、甘氨酸（AMRESCO公司）；氯胺T（三水·N-氯-對甲苯磺酰胺鈉）、羥脯氨酸（東京化成工業(yè)株式會社）；對二甲氨基苯甲醛、考馬斯亮藍R-250（國藥集團化學試劑有限公司）；蛋白質marker（Bio-Rad 公司）；β-巰基乙醇（MP Biomedicals 公司）；MSC 無血清培養(yǎng)基（北京三有利和澤生物有限公司）；TrypLE Express（GIBCO 公司）；CCK-8 試劑（株式會社同仁化學研究所）；透析袋（截留相對分子質量為1000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）；96孔板（艾本德股份公司）；醋酸、正丁醇、氫氧化鈉、過氧化氫、氯化鈉、磷酸二氫鈉、一水檸檬酸、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；實驗用水均為超純水。

Avanti J-26S XP高速低溫離心機（貝克曼庫爾特有限公司）；SQP電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；BioSpectrometer fluorescence 分光光度計（艾本德股份公司）；Christ Alpha 1-4 LSC 型冷凍干燥機（博勱行儀器有限公司）；HBR4 數(shù)顯加熱鍋（IKA 集團）；3111型CO2培養(yǎng)箱［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；Enspire 多模式微孔板檢測系統(tǒng)（PerkinElmer 股份有限公司）；小型垂直電泳槽、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 林蛙皮膠原蛋白的提取

1.2.1 預處理 稱取15 g 新鮮林蛙皮粉，加到300 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液（含過氧化氫0.025%）中進行脫色處理，持續(xù)慢速攪拌，每8 h 換液，直至離心上清接近無色。用10倍體積的蒸餾水（4℃）洗滌樣品至中性。

將水洗至中性的林蛙皮樣品按50 g/L的濃度加至10%的正丁醇溶液中進行脫脂處理，持續(xù)慢速攪拌48 h，每8 h換液。用10倍體積的蒸餾水（4℃）洗滌樣品3次[13,16-18]。

在提取過程中，發(fā)現(xiàn)過氧化氫的加入量對膠原蛋白的提取率影響較大。為了進一步提高林蛙皮膠原蛋白的提取率，分別選取0、0.025%、0.1%、0.25%、1%、2.5%為過氧化氫加入量，以膠原蛋白總提取率為指標，對其進行考察。

1.2.2 酸溶性膠原蛋白（acid-solubilized collagen，ASC）的提取 將預處理后的林蛙皮樣品按50 g/L的濃度加到0.5 mol/L 醋酸溶液中，持續(xù)慢速攪拌48 h，20 000 r/min離心60 min，收集上清液，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶溶性膠原蛋白（pepsin-solubilized collagen，PSC）的提取 取醋酸提取后的殘留物按50 g/L的濃度分散于0.5 mol/L 醋酸溶液（含胃蛋白酶6.7 g/L）中，持續(xù)慢速攪拌24 h，20 000 r/min 離心60 min，收集上清液，以20 倍體積的0.02 mol/L Na2HPO4（pH7.2）為透析介質透析3 d，每12 h 換液一次以去除酶的活性，將透析液25 000 r/min 離心60 min，取沉淀溶于10倍體積的0.5 mol/L醋酸溶液中。第一次離心的沉淀再依次用含0.67%、1.34%、2%胃蛋白酶的醋酸溶液進行提取，處理方法同上。合并所得溶液，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 純化 向所得ASC 與PSC 中加入NaCl 進行鹽析，使NaCl 終濃度為0.9 mol/L。之后進一步用2.6 mol/L NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl 液，pH7.5）沉淀膠原蛋白，20 000 r/min離心45 min，得沉淀。將沉淀溶解于10倍體積的0.5 mol/L醋酸溶液中，先以20倍體積的0.1 mol/L醋酸溶液為介質透析24 h，再以20 倍體積的蒸餾水為介質透析至pH 值為中性，每12 h換液一次。將透析后的溶液置于-20℃過夜預凍后，放入凍干機中真空冷凍干燥，得林蛙皮膠原蛋白成品[13,16-18]。

1.3 紫外光譜檢測

將純化的ASC 與PSC 用0.5 mol/L 醋酸溶液溶解，適當稀釋，在215～400 nm間進行紫外掃描，以驗證膠原蛋白的特征吸收[19]。

1.4 林蛙皮膠原蛋白的含量測定

采用對二甲氨基苯甲醛比色法測定試樣中羥脯氨酸含量[20]，從而推算出林蛙皮膠原蛋白的含量。

稱取適量林蛙皮粉或其膠原蛋白提取物，加入30 mL 3 mol/L 硫酸溶液，于105℃消解16 h；趁熱過濾至250 mL 容量瓶中，用水定容；移取4.00 mL上述溶液于比色管中，加入2.00 mL 氯胺T 試劑，混勻，于室溫下放置20 min；加入2.00 mL顯色劑于比色管中，混勻，封口，迅速放入60℃水浴中，加熱20 min；取出比色管，用流動水冷卻比色管至少3 min，在室溫下放置30 min；以水作為參比，用紫外分光光度計測定D558nm值。羥脯氨酸標準溶液采用4-羥基-a-吡咯甲酸（羥脯氨酸），臨用前配制，其標準工作液濃度依次為0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。

1.5 相對分子質量分布測定

采用SDS-PAGE對所得林蛙皮膠原蛋白的相對分子質量分布進行分析[21-22]，分離膠為8%，濃縮膠為5%。電泳結束后，用2.5 g/L的考馬斯亮藍R-250染色，醋酸與甲醇混合液脫色，對凝膠條帶進行分析。

1.6 膠原蛋白對臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）生長的影響

1.6.1 UCMSC 的培養(yǎng) 取UCMSC，于37℃、CO2含量為5%且濕度飽和的CO2培養(yǎng)箱中，用MSC無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞長到80%左右時進行傳代。

1.6.2 CCK-8 法檢測膠原蛋白對UCMSC 增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶替代物消化后，用無血清培養(yǎng)基稀釋成細胞密度為1×105/mL 的單細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔100 μL，設4 個復孔，在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24 h；將膠原蛋白產(chǎn)物加入無血清培養(yǎng)基中，使終濃度為20 000 μg/mL，4℃浸提48 h；將浸提液依次用無血清培養(yǎng)基稀釋成50、100、500、1000、、5000、10 000、15 000、20 000 μg/mL的溶液，將接種并培養(yǎng)了24 h的96孔板中的培養(yǎng)基棄去，依次加入不同濃度的膠原蛋白浸提液，每孔110 μL，再放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 或48 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，在CO2培養(yǎng)箱中于37℃孵育1 h，用酶標儀測定各孔的D值[10,23]。

為了進一步驗證膠原蛋白對細胞生長的影響，將細胞按1×104/孔種入96 孔板后，將膠原蛋白加入α-MEM 培養(yǎng)基中，使終濃度為20 000 μg/mL，4℃浸提48 h；將浸提液依次用α-MEM 培養(yǎng)基稀釋成50、100、1000、10 000 μg/mL的溶液，將接種并培養(yǎng)了24 h的96孔板中的培養(yǎng)基棄去，PBS洗滌2次，依次加入以上濃度的膠原蛋白浸提液，每孔110 μL，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 或48 h；每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在CO2培養(yǎng)箱中于37℃孵育2 h，用酶標儀測定各孔的D值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果

2.1 林蛙皮膠原蛋白的提取

根據(jù)GB/T 9695.23-2008 測定羥脯氨酸含量，繪制出羥脯氨酸標準曲線（圖1），其標準曲線方程為y=0.202x-0.006，R2=0.9990。經(jīng)考察，該方法精密度、穩(wěn)定性、重復性等均符合要求，RSD均在2%以內，該方法適用于林蛙皮膠原蛋白含量的測定。

隨著過氧化氫含量的提高，膠原蛋白的提取率逐漸下降，但其脫色效果越好（圖2）。綜合考慮脫色效果與膠原蛋白提取率，最終選取0.025%為過氧化氫濃度。

凍干后的成品為淺黃白色纖維狀物質，具有三維孔狀結構。其純度與提取率計算公式如下：

式中，純度為成品中膠原蛋白所占質量分數(shù)，C為消解液中羥脯氨酸的質量濃度，換算系數(shù)為0.1[15,24]。

經(jīng)測定，ASC的提取率為8.77%±0.44%，純度為75.83%±3.78%；PSC 的提取率為30.69%±0.83%，純度為66.39%±1.79%；林蛙皮膠原蛋白總提取率為39.46%±1.15%。

2.2 紫外光譜檢測

膠原肽鏈結構中含有的C=O、COOH 和CONH2都是生色基團，可以產(chǎn)生吸收[25]。膠原蛋白的特征吸收峰在230 nm左右[25]。圖3為ASC和PSC的紫外掃描圖譜，可知所得ASC和PSC的吸收峰分別為230和224 nm，符合膠原特征吸收規(guī)律。

圖1 羥脯氨酸含量測定標準曲線

2.3 相對分子質量分布測定

對所提取的膠原蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果見圖4。在相對分子質量116×103附近有2 條相鄰的分離帶，此為天然膠原α鏈的分離帶，分別代表α1 和α2 亞基[26]。而圖譜中α1 條帶的強度明顯高于α2 條帶，約為α2 條帶強度的2 倍，因此推測所得膠原蛋白為含有2 條α1 鏈、1 條α2 鏈的Ⅰ型膠原[12]。在200×103附近的分離帶為天然膠原的β鏈（α鏈的二聚體）[12,26]。電泳圖譜表明所提取的膠原蛋白為保持了三股螺旋結構特征的膠原蛋白。

2.4 膠原蛋白對UCMSC增殖的影響

將細胞與不同濃度的膠原蛋白提取物浸提液分別孵育24、48 h 后檢測細胞的存活情況，結果見圖5。在0.05～20 mg/mL濃度范圍，無論ASC還是PSC，無論是以MSC 無血清培養(yǎng)基還是以α-MEM 培養(yǎng)基作為浸提介質，其對UCMSC 的增長均無抑制作用，細胞存活率＞83.86%，且部分濃度（如0.1 mg/mL）時膠原蛋白顯現(xiàn)出了促進細胞生長的趨勢。

3 討論

圖2 過氧化氫含量對膠原蛋白提取率的影響

圖3 ASC與PSC的紫外掃描圖譜

迄今，國內外關于中國林蛙皮膠原蛋白的研究報道較少，如呂玲玲等應用木瓜蛋白酶在室溫下提取林蛙皮膠原蛋白[6]，王長周、張根生等在50℃提取林蛙皮膠原蛋白肽及殘體膠原蛋白[3,27]，鄭淼、李琳琳等應用胃蛋白酶在37℃條件下提取林蛙皮膠原蛋白[15,24]。由于低等脊椎動物和無脊椎動物中膠原蛋白變性溫度較低，一般低于豬皮膠原蛋白的變性溫度37℃[28]，有的甚至低達15℃[29-30]，因此易發(fā)生膠原變性，不利于膠原蛋白生物活性的保持[4]。朱瑞霞等雖然在4℃用醋酸與胃蛋白酶提取了膠原蛋白，但是可能由于預處理不完全且提取參數(shù)有待進一步優(yōu)化，其提取率較低[31]。鑒于此，本研究為獲得具有生物活性的膠原蛋白，整個提取與純化過程均在4℃條件下完成。在膠原蛋白提取過程中，由于膠原分子之間與分子內部會通過端肽區(qū)域的醛基縮合反應產(chǎn)生共價鍵進行交聯(lián)，導致其在酸中的溶解度下降，所以林蛙皮不能完全溶于0.5 mol/L 的醋酸溶液，其ASC 得率較低，這一點與Jongjareonrak、Zhang 等的研究結果一致[12,21]。而胃蛋白酶可以在不損害三螺旋結構的情況下切斷交聯(lián)分子之間的端肽的交聯(lián)作用，使三股螺旋結構的主體部分仍然保留并可溶解在酸中[12,21]，所以限制性酶消化法可以提高膠原蛋白的提取率，更有效地得到活性蛋白。本研究通過低溫酸酶提取相結合的方法，成功地從林蛙皮粉中提取了膠原蛋白，經(jīng)初步測定，提取率高達39.46%±1.15%，且林蛙皮中膠原蛋白的質量分數(shù)達25.40%，與鄭淼等26%的研究結果一致[15]。由于大部分蛋白質含有酪氨酸與色氨酸殘基，在280 nm處有最大吸收[17]；但膠原蛋白中酪氨酸殘基含量低，其最大吸收波長在230 nm左右，這可能與膠原肽鏈結構中含有C=O、COOH 和CONH2等生色基團有關[17,25]。紫外光譜掃描結果與SDS-PAGE結果均表明所提取的膠原蛋白仍保持三股螺旋結構特征，為Ⅰ型膠原蛋白，具有較好的生物學活性。

圖4 ASC與PSC的電泳結果

圖5 不同濃度膠原蛋白浸提液對細胞生長的影響

膠原是細胞外基質的主要成分，有利于細胞的黏附、增殖和分化[32]。間充質干細胞是一類起源于中胚層的成體干細胞，可從骨髓、脂肪、胎盤、臍帶血及臍帶中分離純化，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能[33]。對UCMSC 增殖影響的實驗結果表明，在0.05～20 mg/mL濃度范圍，膠原蛋白提取物對細胞生長無明顯抑制作用，且部分濃度顯現(xiàn)出了促進細胞增殖的趨勢，證明林蛙皮膠原蛋白可作為組織工程支架材料的潛在來源。

總之，林蛙皮相對于陸生脊椎動物的皮膚而言，其脂肪含量低、雜蛋白較少，利于膠原蛋白的精制，可以成為一種新的膠原蛋白來源。并且，對林蛙皮膠原蛋白的初步生物學性狀研究表明，其具有良好的生物學活性與相容性，在組織工程、保健品以及化妝品領域均具有良好的應用前景。

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