陳立 馮學泉 萬晨光 左娜 穆紅

目前，針對腦死亡供體（donation after brain death，DBD）器官的保護效果不甚理想，即使在西方發(fā)達國家，仍有約25%的潛在DBD器官在維護過程中逐漸失去功能。研究［1，2］表明腦死亡過程可誘導炎癥和免疫反應的發(fā)生，從而對潛在供體器官的質(zhì)量造成損傷。因此，為提高DBD器官質(zhì)量，有必要就腦死亡過程急性炎癥反應進行深入探討。白細胞介素－8（interleukin－8，IL－8）亦稱為嗜中性粒細胞趨化因子，為公認的介導炎性反應的細胞因子。其來源可以是單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和表皮細胞等，生物學作用不但能趨化嗜中性粒細胞，而且趨化T淋巴細胞和嗜堿性粒細胞，在殺傷病原微生物的同時也會對自身組織細胞造成損傷。

本文通過對實驗長白小豬的腦死亡模型時間序列IL－8的水平檢測研究，進一步為DBD器官抗炎損傷的保護提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康、清潔級長白小豬7頭，體質(zhì)量（33.6±4.7）kg，雌雄不限，購自天津市動物實驗中心。術前禁食12 h，禁水6 h。

1.2 主要設備 美國強生Codmen顱內(nèi)壓監(jiān)測儀；以色列RIMED公司經(jīng)顱多普勒（transcranial doppler，TCD）； 美國BIOPAC公司MP150型 16通道生理信號記錄分析系統(tǒng)；美國HARVARD動物手術臺；美國Matrx model 3000型動物麻醉機；深圳Beneview T8麻醉監(jiān)護儀；美國Cobas DDP全自動生化分析儀。

1.3 腦死亡模型建立 取豬稱重，麻醉后備皮，股動、靜脈插管，分別接壓力傳感器（描記動脈壓）和靜脈通道；氣管插管接微型呼吸器并監(jiān)測呼吸波；連接心、腦電圖電極監(jiān)測心、腦電圖；膀胱造瘺；顱頂正中開孔經(jīng)導管漸進式注入生理鹽水，直至達到腦死亡標準。靜脈滴注多巴胺≤10μg／kg·min維持循環(huán)，觀察心電圖、血壓及血氣的變化。

腦死亡判定標準及顱內(nèi)加壓停止標準參考我國2009年頒布的《腦死亡判定標準（成人）》［3］，擬定腦死亡判定標準如下：（1）瞳孔對光反射消失；（2）角膜反射消失；（3）刺激豬頭面部，實驗豬無反應；（4）無自主呼吸；（5）經(jīng)TCD顯示振蕩波、尖小收縮波或血流信號消失；（6）腦電圖顯示電靜息；（7）阿托品試驗陰性。首次判定12 h后再次復查，結果仍符合腦死亡判定標準者，方可最終確認為腦死亡。

1.4 頸內(nèi)靜脈取血時間點及處理 麻醉、插管、放置探頭等處理后，分別在顱內(nèi)加壓前、腦死亡0 h、腦死亡3 h、腦死亡6 h、腦死亡9 h各時間點取靜脈血5 ml，室溫靜置 1－2 h 后，以離心半徑 15 cm，3000 r／min離心10 min分離血清，置于－80℃保存待測。

1.5 IL－8及腎功能指標檢測 采用免疫芯片熒光定量法檢測血清IL－8水平，試劑由廣州RayBiotech公司提供。采用美國Cobas DDP全自動生化分析儀及其配套試劑檢測血清尿素、肌酐（creatinine，Cr）水平。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。IL－8 檢測結果采用 M（P25～P75）表示，腦死亡后各時間點與腦死亡前IL－8檢測結果比較采用Mann－Whitney U檢驗，腦死亡后各時間點IL－8檢測結果比較采用獨立樣本非參數(shù)Kruskal－Wallis H檢驗；腎功能指標檢測結果以±s表示，腦死亡后各時間點與腦死亡前腎功能指標檢測結果比較采用獨立樣本t檢驗；IL－8各時間點檢測結果與腎功能指標間的相關性分析采用雙側Spearman相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腦死亡前后各時間點 IL－8檢測結果比較腦死亡后 IL－8 檢測結果開始升高，3 h、6 h、9 h 的IL－8檢測結果均高于腦死亡前，且差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。腦死亡后各時間點 IL－8 的檢測結果差異無統(tǒng)計學意義（H＝7.840，P＝0.098），見表1，圖1。

表1 腦死亡前后各時間點IL－8檢測結果比較［M（P25～P75），pg／mL］

2.2 腦死亡前后各時間點尿素、Cr檢測結果比較腦死亡后3 h、6 h、9 h的尿素檢測結果均高于腦死亡前，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。腦死亡后6 h、9 h的Cr檢測結果均高于腦死亡前，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），見表2，圖2、3。

2.3 腦死亡后血清IL－8水平與腎臟功能指標的相關性分析結果 腦死亡后血清IL－8與尿素檢測結果呈正相關性（r＝0.453，P＝0.012），與Cr檢測結果無相關性（r＝0.209，P＝0.267）。

圖1 腦死亡前后各時間點IL－8檢測結果

圖2 腦死亡前后各時間點血清尿素檢測結果

圖3 腦死亡前后各時間點血清Cr檢測結果

3 討論

表2 腦死亡前后各時間點尿素、Cr檢測結果比較（±s）

表2 腦死亡前后各時間點尿素、Cr檢測結果比較（±s）

注：＊與腦死亡前比較，P＜0.05

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腦死亡是一個復雜的病理生理過程。近年的研究［2］結果顯示，腦死亡可造成血流動力學的劇烈改變、交感神經(jīng)系統(tǒng)的改變、內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝的改變，激活諸多細胞因子，引起機體內(nèi)環(huán)境的紊亂、激素濃度的改變、內(nèi)分泌代謝的顯著變化以及炎性和免疫反應的激活，從而導致潛在腦死亡供體器官的損傷。因此，腦死亡過程可誘導多種促炎癥因子的釋放并能激活細胞因子間的級聯(lián)反應。IL－8為1987年Yoshimura 發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為（8～10）×103的多肽，是機體的重要炎性反應細胞因子之一。主要作用可誘導嗜中性粒細胞形態(tài)改變并驅(qū)化炎性反應，同時引起細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高、顆粒內(nèi)含物釋放、黏附蛋白上調(diào)，生物活性脂質(zhì)形成和呼吸爆發(fā)，釋放超氧化物和溶酶體酶，從而促進炎性反應導致細胞損傷［2，4］。

本文研究結果顯示，長白小豬腦死亡0 h時血清IL－8濃度較腦死亡前有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。腦死亡 3 h 時 IL－8 檢測水平較腦死亡前水平明顯升高，腦死亡6 h時IL－8水平達高峰，之后逐漸下降，上述研究結果提示IL－8升高為腦損傷及腦死亡發(fā)生時的應激反應，與相關報道［4］IL－8的反應強度與腦損傷程度及腦死亡進程有關相一致。但本文研究結果顯示，腦死亡后各時間點IL－8的檢測結果差異無統(tǒng)計學意義，推測與本文研究中長白小豬腦死亡模型的形成過程緩慢而平穩(wěn)，并非急性腦損傷導致的腦死亡有關。而IL－8檢測結果出現(xiàn)先升高后降低趨勢，推測與隨著時間推移，應激反應減弱以及IL－8半衰期較短導致其濃度達到高峰后逐漸衰減有關。因此，為保護DBD器官，應盡可能早地，至少在腦死亡后6 h即IL－8達到高峰之前采取干預措施，以有效降低腦死亡進程中IL－8所致的炎性器官損傷。腎功能指標尿素升高與IL－8同步，Cr稍有滯后，且Cr濃度在腦死亡后3 h內(nèi)出現(xiàn)輕度下降，之后逐漸升高，可能由于抗利尿激素急劇下降、腎灌注尚可而形成的暫時性腎小球濾過相對增強所致［4］。但尿素與Cr在腦死亡3 h后均隨時間推移表現(xiàn)出不可逆的上升趨勢，與IL－8在腦死亡9 h 之后檢測結果逐漸下降不同。據(jù)報道［5，6］，腦死亡后光鏡下可見腎小管內(nèi)有均質(zhì)狀粉染物，腎小管上皮細胞腫脹，界限不清，管腔狹窄閉塞，部分可見炎癥細胞浸潤，少數(shù)腎小管細胞壞死。說明腦死亡早期，腎臟組織即可出現(xiàn)明顯的病理生理改變。本文研究將IL－8檢測水平與腎功能指標具體檢測數(shù)據(jù)做相關性分析的結果顯示，IL－8水平與尿素的變化呈正相關，而與Cr的變化無相關性，從而進一步證實了腦死亡早期升高的IL－8因子可造成組織器官局部嗜中性粒細胞聚集并首先攻擊腎小管，引起腎小管的炎性損傷，但其對腎小球損傷相對較輕，尿素升高的原因可能是IL－8的升高激活嗜中性粒細胞對組織細胞的損傷，組織細胞壞死及凋亡后出現(xiàn)的蛋白質(zhì)降解造成尿素來源的增高，最終導致血液尿素濃度的升高［7，8］。

綜上所述，腦死亡可引起機體大量釋放IL－8，并可導致組織器官的不可逆性損傷。因此，臨床為保護潛在移植器官應在腦死亡確立以后及時采取有效的血液凈化吸附IL－8，以盡可能降低組織器官的炎性損傷。

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