張爽

（遼寧省錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

細(xì)胞工廠培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒工藝優(yōu)化研究

張爽

（遼寧省錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種高度接觸性傳染病，呈地方流行性。PRRSV只感染豬，各種品種、不同年齡和用途的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感。本病尚無有效治療藥物，疫苗免疫接種是預(yù)防和控制PRRS的根本措施。

目前，PRRSV主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過程中無法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，產(chǎn)量低等問題。進(jìn)而我們進(jìn)行了用細(xì)胞工廠培養(yǎng)PRRSV的試驗(yàn)研究。

1 材料

1.1 毒株

PRRSV（HuN4-F112株），購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，進(jìn)口胎牛血清購自Hyclone，胰酶購自Washington公司，Nunc EasyFill細(xì)胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL）購自Thermo Fisher。

1.3 細(xì)胞及傳代培養(yǎng)

細(xì)胞：Marc-145細(xì)胞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室已擴(kuò)增凍存，目前在本實(shí)驗(yàn)室傳至75代，已經(jīng)適應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基中生長。

2 方法

2.1 細(xì)胞傳代的方法

首先復(fù)蘇所選擇的種細(xì)胞Marc-145到T75的細(xì)胞瓶中，生長48h左右，按照1:4的比例進(jìn)行傳代；然后把6個(gè)長滿細(xì)胞的T75細(xì)胞瓶中的細(xì)胞傳到1個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行培養(yǎng)；48h左右按照1:3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)；該過程中使用的培養(yǎng)基為DMEM，血清為胎牛血清，使用量為10%。

收獲轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞：將轉(zhuǎn)瓶中所得細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后加入濃度為0.25%胰酶-EDTA溶液125mL消化，收集細(xì)胞。

收獲得細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后，采用Thermo Scientific Nunc細(xì)胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL)對Marc-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；所用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基。所用其它試劑包括牛血清、TPCK-胰酶等。細(xì)胞接種后在12h、24h、48h取樣觀察細(xì)胞在細(xì)胞工廠上的生長狀況。

2.2 豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒在細(xì)胞工廠中增殖條件優(yōu)化

分別研究了細(xì)胞密度、病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）、維持液中血清濃度和病毒吸附時(shí)間4個(gè)因素對藍(lán)耳病病毒（PRRSV）增殖的影響，比較PRRSV病毒在不同增殖條件下TCID50的差異。

2.2.1 細(xì)胞密度對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒增殖的影響在不同細(xì)胞密度（表1），按MOI=0.2接種病毒，37℃培養(yǎng)，CPE達(dá)80%左右收獲病毒，比較PRRS病毒TCID50，結(jié)果見表1。

表1 不同細(xì)胞密度接毒病毒TCID50

從表1中可以看出，細(xì)胞密度為0.8×105細(xì)胞/mL時(shí)，PRRSV的病毒滴度達(dá)到了108.15；優(yōu)于其它處理。因此，本發(fā)明利用細(xì)胞工廠增殖PRRS病毒的細(xì)胞密度確定為0.8× 105細(xì)胞/mL。

2.2.2 病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）對PRRS病毒增殖的影響在細(xì)胞密度為0.8×105細(xì)胞/mL，按MOI=0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5分別接種PRRS病毒，37℃培養(yǎng)，CPE達(dá)80%左右收獲病毒。比較PRRS病毒TCID50，結(jié)果見表2。

表2 不同病毒感染復(fù)數(shù)對PRRSV增殖的影響

從表2中可以看出，病毒感染復(fù)數(shù)MOI為0.8時(shí)，PRRS病毒滴度達(dá)到了108.41；優(yōu)于另外幾種處理。病毒感染量過低使增值速度降低，無法達(dá)到較高的病毒滴度。因此，本發(fā)明利用細(xì)胞工廠增殖PRRS病毒的病毒感染復(fù)數(shù)MOI為0.8，病毒增值速度較快，且達(dá)到較高的TCID50。

2.2.3 血清濃度對PRRS病毒增殖的影響在細(xì)胞密度為0.8×105細(xì)胞/mL，按MOI=0.8接種PRRS病毒，血清濃度分別為1%、2%、3%、4%和5%，37℃培養(yǎng)，CPE達(dá)80%左右收獲病毒，測定TCID50，結(jié)果見表3。

表3 不同血清濃度對病毒增殖的影響

從表3中可以看出，當(dāng)維持液中血清濃度在1%～3%之間，病毒的病毒滴度變化不明顯且滴度很高，所以維持的濃度保持在1%～3%之間即可。

2.2.4 病毒吸附時(shí)間對PRRS病毒增殖的影響在細(xì)胞密度為0.8×105細(xì)胞/mL，按MOI=0.8接種PRRS病毒，病毒維持液中血清濃度為2%，37℃培養(yǎng)，CPE達(dá)到80左右收獲病毒，比較PRRS病毒滴度，結(jié)果見表4。

表4 不同病毒吸附時(shí)間對病毒增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在靜止接毒過程中，PRRSV吸附時(shí)間不宜過長也不宜過短，這樣都會早產(chǎn)病毒滴度降低。時(shí)間短，病毒還沒有吸附到細(xì)胞中去，時(shí)間長，細(xì)胞由于長時(shí)間吸收不到營養(yǎng)，對細(xì)胞的生長造成影響，從而間接影響到病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，從而影響了病毒滴度。

3 結(jié)果

3.1 PRRSV在細(xì)胞工廠中增殖條件的優(yōu)化結(jié)果

綜上，確定PRRS病毒在細(xì)胞工廠中增殖的最佳條件為：細(xì)胞密度0.8×105細(xì)胞/mL；按MOI=0.8接種PRRS病毒；病毒維持液中血清濃度為1%～3%；病毒吸附時(shí)間為1h，37℃培養(yǎng)。

3.2 病毒含量測定結(jié)果

利用TCID50方法進(jìn)行病毒含量的測定。病毒TCID50測定時(shí)，以MEM培養(yǎng)液將培養(yǎng)得到的PRRSV液作連續(xù)10倍稀釋，即10-1、10-2……10-8，每個(gè)稀釋度取100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，隨后加入經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化分散的Marc-145細(xì)胞懸液，每孔100μL（細(xì)胞含量以3× 105/mL左右為宜），每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)正常細(xì)胞培養(yǎng)對照，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和對照，共觀察2～5d，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。同時(shí)以相同的方法對用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的PRRS病毒液進(jìn)行TCID50測定。以此作為對照組。

表5 PRRSV含量培養(yǎng)時(shí)間（5d）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，由結(jié)果表明，利用又細(xì)胞工廠培養(yǎng)的PRRSV液病毒含量高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的PRRSV液病毒含量。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用細(xì)胞工廠培養(yǎng)的PRRSV顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒含量。細(xì)胞工廠培養(yǎng)病毒方法，體現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)和規(guī)?；a(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞和病毒的趨勢，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝相比，抗原效價(jià)提高顯著，而且產(chǎn)品質(zhì)量均一；生產(chǎn)工藝簡化，操作簡單，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.020