王召璐 馮慧云 李 艷 許 濤 薛澤春 李連之

(聊城大學化學化工學院，聊城252059)

基于多肽與金屬離子作用的一種高選擇性Cd2+熒光比率傳感器

王召璐 馮慧云 李 艷 許 濤 薛澤春 李連之＊

(聊城大學化學化工學院，聊城252059)

利用固相多肽合成法合成了一種新的多肽，將該多肽與熒光基團Dansyl偶聯制備了一種新的熒光化學比率傳感器：Dansyl-Cys-Pro-Pro-Cys-Trp-NH2。利用熒光光譜研究了它與金屬離子的相互作用。結果表明，與其它13種金屬離子相比該多肽對金屬Cd2+有很好的選擇性。它能特異性識別Cd2+，具有水溶性好，響應時間快等優(yōu)點。該肽對Cd2+具有很強的鍵合作用，其結合常數為3.0×1011L2·mol-2，檢出限為11.5 nmol·L-1。

多肽；Cd2+；熒光化學傳感器；熒光比率；熒光共振能量轉移

鎘(Cd)是一種危害性很大的重金屬，它能夠通過食物鏈在人和其他動物的體內積累，引起肝病、肺病和慢性腦炎等疾病[1]。長期暴露在Cd2+源中甚至可引某些癌癥[2]。上世紀發(fā)生在日本的“骨痛病”就是由于人們長期食用“鎘米”和飲用含鎘的水造成的鎘慢性中毒[3]。按世界衛(wèi)生組織標準，瓶裝水中鎘不超過40 nmol·L-1[4]，因此鎘離子的檢測尤為重要。研究高靈敏性、高選擇性和快速檢測鎘離子方法具有重要意義。雖然已有一些儀器方法如原子吸收等可以靈敏地檢測鎘離子[5]，但存在著儀器昂貴、不能及時現場檢測、制備樣品復雜等缺點，難以被廣泛普及。近年來，用于檢測金屬離子的化學傳感器引起人們的廣泛關注，主要是由于它們具有簡單快速，對待測金屬離子有高的選擇性和靈敏性[6-10]。其中熒光化學傳感器已成為引人注目的檢測重金屬離子的理想化學傳感器[11-12]。典型的熒光化學傳感器的結構包含有2個組成元件，一個是產生信號的熒光基團，另一個是具有客體識別能力的接受體。接受體用來選擇性的辨別和鍵合金屬離子，作為受體的熒光基團主要用來傳遞熒光信號。一個理想的熒光傳感器應具有易合成、水溶性好、靈敏性高、選擇性好、檢出限低等特點[13]。目前報道的大部分熒光傳感器含有有機分子組成的螯合單元，這些螯合單元的合成條件非?？量潭宜鼈兊逆I合往往不是可逆的[14-16]。鑒于有機分子的這些弱點，用于檢測金屬離子的多肽傳感器引起人們的注意。多肽基傳感器有以下優(yōu)點[17-20]：由天然氨基酸組成，很容易通過固相多肽合成法(SPPS)合成；選擇性和靈敏性能通過進一步地改變氨基酸序列來進行優(yōu)化；能應用于水溶液。最早報道的多肽基熒光傳感器是基于鋅指蛋白的一個含有25個氨基酸殘基的肽[21]。用于檢測Zn2+、Cu2+、Hg2+的多肽傳感器已有報道[22]。然而，目前用于檢測Cd2+的肽基熒光傳感器還很少[23-24]。近年來，對于重金屬離子檢測的比率熒光傳感器變得引人注目，主要是由于它們使得以最小空白信號更準確地測量分析物成為可能[25-26]。Lee等報道過一種肽基比率熒光傳感器，用于在水溶液中檢測Hg2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+和Ag+等[27]，但選擇性不理想。

我們實驗室報道了一種檢測Cd2+的多肽熒光傳感器[28]。本文通過對其多肽序列進行優(yōu)化合成了一個新的多肽熒光傳感器Dansyl-Cys-Pro-Pro-Cys-Trp-NH2(簡寫為D-P5)，利用熒光光譜研究了它與重金屬離子的相互作用。結果表明，Cd2+離子對其具有獨特的熒光增強效應，與我們以前報道的相比提高了它的檢出限。此方法簡便快速、成本低廉，有望得到實際應用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Fmoc-L-Trp(Boc)-OH(色氨酸)、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH(半胱氨酸)、Fmoc-L-Pro-OH(脯氨酸)和Fmoc-LCys(Trt)-OH(半胱氨酸)，Rink Amide樹脂，o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1.2 mmol N，N-二異丙基乙胺(DIEA)和茴香硫醚均為上海吉爾生化公司產品；乙二硫醇(EDT)、三氟乙酸(TFA)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及各種金屬鹽等均為市售分析純試劑。丹黃酰氯購自北京普益華科技有限公司。實驗中所用的各種金屬離子溶液均用含100 mmol·L-1NaClO4的50 mmol·L-1HEPES(pH 7.0)緩沖溶液新鮮配制。

CS136多肽合成儀(美國C S Bio Co.)；CR22G高速冷凍離心機(日本日立公司)；LS55熒光分光光度計(美國Perkin Elmer公司)；Q-Star XL電噴霧質譜儀(美國ABI公司)。

1.2 多肽的合成

多肽的合成在CS136固相多肽合成儀上進行，采用的是標準的Fomc固相合成法[29]。按取代度0.66 mmol·g-1計算稱取0.2 mmol的Rink Amide樹脂置于反應瓶中，加入適量DMF溶脹1～2 h。在對應的氨基酸儲瓶中加入0.6 mmol HBTU和1.2 mmol DIEA的DMF溶液和0.6 mmol相應的氨基酸，按肽鏈順序從C端向N端依次加入氨基酸Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Pro-OH和Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，根據設定的程序自動進行反應。每次偶合反應之后均用茚三酮顯色法檢測，若樹脂無色或淡黃色證明反應完全，若樹脂呈藍紫色需延長時間或者加大氨基酸的量等方法再次偶合。丹黃酰氯的偶合步驟是：將1.2 mmol HBTU和0.6 mmol的丹黃酰氯用10 mL的DMF溶解后，按設定好的程序自動反應。所有氨基酸偶合完成后，用無水甲醇洗滌樹脂，真空干燥。然后進行多肽D-P5的切割，稱量干燥的樹脂，按質量的10倍加入切割液(82.5%三氟乙酸+5%水+5%苯酚+5%茴香硫醚+2.5%乙二硫醇)，常溫下避光切割3～4 h，過濾，樹脂用少量TFA洗滌，保留濾液[30]。用高純氮氣吹去TFA，加入5～10倍量冰冷的無水乙醚，置-20℃靜置過夜，析出白色絮狀沉淀，離心收集沉淀，用少量無水乙醚洗滌，真空干燥。由制備型液相色譜純化得到的多肽的凍干粉在純水中溶解后，用分析型高效液相色譜儀進行分析。分析柱為Spherigel C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)流動相A：0.1% TFA水溶液，B：甲醇。線性梯度：20%B-100%B，洗脫時間為30min，進樣量20μL，流速為1mL·min-1，檢測波長為275 nm。

1.3 熒光光譜的測定

1.3.1 Cd2+的熒光響應研究

將五肽溶于含100 mmol·L-1NaClO4的50 mmol·L-1HEPES(pH 7.0)緩沖溶液中，在比色皿中準確加入3.0 mL 10 μmol·L-1D-P5溶液，然后用微量進樣器逐次加入Cd2+(1 mmol·L-1)溶液，使Cd2+的濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol·L-1。固定激發(fā)波長分別為290 nm和330 nm，分別測量310～570 nm和400～640 nm范圍的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5和10 nm。掃描速度為：300 nm·min-1。加入的金屬離子溶液總體積為30 μL，遠小于3.0 mL，所以實驗中體積變化可忽略。

1.3.2其它金屬離子的熒光響應研究

在比色皿中準確加入3.0 mL 10 μmol·L-1D-P5溶液，測定其熒光發(fā)射光譜。然后分別加入等物質的量的用相同緩沖液配制的Cd2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+、Cr3+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Na+和K+溶液，使金屬離子的濃度均為10 μmol·L-1。固定激發(fā)波長為290 nm，測量310～570 nm范圍內的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5和10 nm，掃描速度為：300 nm·min-1。

1.3.3 pH值對D-P5及D-P5/Cd2+熒光光譜的影響

用50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1NaClO4(pH 7.0)緩沖溶液配制10 μmol·L-1的D-P5溶液，然后用0.1 mol·L-1的HCl和0.1 mol·L-1的NaOH調節(jié)pH值。測量D-P5及D-P5/Cd2+的熒光光譜，測量條件同1.3.2。

1.4 檢出限的確定[27]

D-P5對Cd2+檢出限的確定是基于D-P5與Cd2+滴定曲線。為了確定S/N，重復測量10次D-P5的熒光光譜，然后確定空白的標準偏差。對不同Cd2+濃度對應的熒光強度對Cd2+濃度的圖像進行線性擬合，得出斜率.通過下面的方程計算檢出限：

其中SD為空白的相對標準偏差，m代表直線的斜率。

2 結果與討論

2.1 多肽的合成

采用標準的Fomc固相合成法合成了一個新的多肽Dansyl-Cys-Pro-Pro-Cys-Trp-NH2。將D-P5經過高效液相色譜圖分析，在高效液相色譜上20～22 min內有一個尖峰，而其他的峰很小可以忽略。說明D-P5的純度還是比較高的。電噴霧質譜中的質子峰m/z=837.29和m/z=859.57分別對應于[D-P5+H]+和[D-P5+Na]+。它們與該肽的分子量836.4相吻合，這表明合成的肽的正確性。

2.2 熒光光譜

2.2.1 Cd2+的熒光響應研究

D-P5的熒光光譜測量是在50 mmol·L-1HEPES緩沖溶液中進行的。圖1(A)為以290 nm激發(fā)時，不同濃度Cd2+存在下D-P5的熒光光譜圖。從圖中可以看到，360 nm處有一弱的發(fā)射峰，510 nm處有一強的發(fā)射峰，它們分別是Trp基團和dansyl基團的熒光發(fā)射響應。隨著Cd2+濃度從0增加到10 μmol·L-1，510 nm處的熒光強度逐漸增強而在360 nm處的熒光強度卻逐漸減弱。從內嵌圖可以看出，熒光發(fā)射比率F510/F360從2.88增加到19.45。當cCd2+∶cD-P5=1∶2時，F510/F360比值出現拐點，說明D-P5與Cd2+的結合比為2∶1。這個結果表明，在Cd2+存在下，D-P5發(fā)生了熒光共振能量轉移(FRET)，即Cd2+與多肽中半胱氨酸殘基上的-SH發(fā)生配位作用，使D-P5發(fā)生折疊，從而拉近了Trp和dansyl之間的距離[29]，此時Trp基團作為能量供體將能量無輻射地轉移給作為能量受體的dansyl基團。這種能量轉移導致了熒光光譜中360 nm處熒光強度的降低和510 nm處熒光強度的增加。

圖1 不同濃度的Cd2+存在下D-P5的熒光發(fā)射光譜Fig.1Fluorescence emission spectra of D-P5 in the presence of different concentration of Cd2+

當以330 nm為激發(fā)波長時只可以觀測到Dansyl基團在510 nm處的熒光響應。如圖1(B)，將Cd2+逐漸加入D-P5溶液中時，可以看出510 nm波長處的熒光發(fā)射強度逐漸增加。這說明由于多肽與Cd2+的結合，Cd2+配位阻斷了從螯合團到熒光團的光致電子轉移過程，導致熒光增強[22]。可能其他因素也會參與導致熒光增強效應。從內嵌圖中可以看出，當cCd2+∶cD-P5=1∶2時發(fā)射強度達到飽和狀態(tài)，說明DP5與Cd2+的結合比為2∶1。

值得注意的是，圖1中2個滴定曲線圖顯示飽和配位后具有不同趨勢：比例計量滴定曲線顯示達到1∶2配位后探針發(fā)射雙帶比例以另一較小的斜率增大，似有另一結合過程；然而增強滴定曲線顯示達到1∶2配位后不再發(fā)生新的變化。為解釋這一現象，我們將圖1(A)中的比例計量滴定曲線數據分開，分別做出F510對cCd2+∶cD-P5和1/F360對cCd2+∶cD-P52個圖(未給出，與圖1(B)和圖1(A)中插圖類似)。從所得圖中可知，當達到1∶2配位后探針在510 nm處的熒光強度幾乎不變化，與增強滴定曲線的結論一致，并沒有發(fā)生新的變化。但達到1∶2配位后1/F360曲線以另一較小的斜率增大，與比例計量滴定曲線的結論一致。這說明在達到1∶2配位后，360 nm處的熒光強度還存在一個較小程度的猝滅現象，而510 nm處的熒光強度幾乎沒有變化。360 nm處的熒光是色氨酸殘基(Trp)發(fā)射峰，這說明當Cd2+達到飽和后，繼續(xù)加入Cd2+會使Trp發(fā)生熒光猝滅作用，使360 nm處的熒光強度降低。

圖2是D-P5與Cd2+相互作用可能的機理圖。當Cd2+存在時，使D-P5發(fā)生折疊，Trp和Dansyl之間的距離接近，為D-P5發(fā)生了熒光共振能量轉移(FRET)，Trp基團作為能量給體將能量無輻射地轉移給作為能量受體的Dansyl基團提供了條件。從紫外燈下的圖片可以看出，加入Cd2+前后，D-P5有明顯的顏色變化，從無色變?yōu)闇\綠色，可以定性的檢測Cd2+。

圖2 D-P5與Cd2+作用的可能鍵合模式和紫外光下加入Cd2+前后D-P5溶液的熒光照片Fig.2Proposed possible binding mode of D-P5 with Cd2+and the fluorescence image of D-P5 solution before and after addition of Cd2+under ultraviolet light

2.2.2 多種金屬離子的熒光響應研究

為了探討D-P5對金屬離子結合的選擇性，研究了D-P5溶液對其它金屬離子的熒光響應。測定了包括一些過渡金屬離子和主族金屬離子與D-P5相互作用的熒光光譜。

通過熒光比率F510/F360來體現和比較它對不同金屬離子的選擇性。圖3為不同金屬離子存在時DP5溶液熒光比率(F510/F360)增量的柱狀圖。結果表明，向D-P5溶液中分別加入1倍的Co2+、Ni2+、Cr3+、Ca2+、Mn2+、Al3+和1 000倍的Na+、Ca2+、K+、Mg2+等離子后，熒光比率沒有明顯的變化。加入1倍的Hg2+、Cu2+、Pb2+、Ag+、Zn2+后熒光比率稍有增強。值得注意的是D-P5/Cd2+的熒光比率分別為D-P5/Cu2+、D-P5/Zn2+和D-P5/Hg2+的2.03倍，2.13倍和2.42倍，這說明這些離子對Cd2+檢測的干擾較小。實驗表明，D-P5對Cd2+有很高的選擇性。因此，可以成為檢測Cd2+的傳感器從而應用于實踐中。

圖3 金屬離子存在時D-P5溶液熒光比率(F510/F360)增量Fig.3Increment of fluorescence ratio(F510/F360)of the peptide in the presence of different metal ions

由于堿金屬離子大量存在于環(huán)境及生物體中，所以研究了在D-P5/Cd2+體系中存在大量第Ⅰ、Ⅱ主族金屬離子時的熒光響應。如圖4，當堿金屬離子的濃度達到Cd2+濃度的1 000倍，D-P5/Cd2+體系的熒光發(fā)射強度卻沒有受到明顯的影響。這個結果說明堿金屬和堿土金屬的存在對重金屬Cd2+的檢測幾乎沒有干擾。

圖4 Na+、K+、Mg2+、Ca2+離子存在時D-P5/Cd2+體系的熒光強度柱狀圖Fig.4Fluorescence intensity of D-P5/Cd2+in the presence of various metal ions

為考察不同陰離子對該體系熒光性質的影響，在相同實驗條件下測定了不同陰離子存在下D-P5熒光光譜。如圖5所示，在D-P5溶液中分別加入不同的鈉鹽，當鈉鹽的濃度達到D-P5的1 000倍時，D-P5在510 nm處的熒光發(fā)射強度幾乎沒有發(fā)生變化。這說明這些陰離子對Cd2+的檢測幾乎沒有干擾。

圖5 不同陰離子對D-P5 510 nm處熒光強度的影響Fig.5Fluorescence intensity of D-P5 at 510 nm in the presence of various anion ions

多肽對于金屬離子的選擇性鍵合作用機制主要由兩者的本性決定，主要與多肽的氨基酸種類、序列和結構構象有關。這個探針中有特殊的Cys-XX-Cys結構，根據軟硬酸堿理論，-SH作為典型的軟堿性配位基團很容易與作為軟酸的Cd2+選擇性結合，當然還與多肽的空間結構相關。

2.3 pH值對D-P5及D-P5/Cd2+熒光光譜的影響

體系的pH值是一個重要的參數，因此我們研究了pH對D-P5及D-P5/Cd2+熒光光譜的影響。從圖6可以得知，當pH值低于5時D-P5及D-P5/ Cd2+熒光強度都很弱，這說明此時Cd2+與D-P5的相互作用很弱。當pH≥5時，D-P5/Cd2+的熒光比率F510/F360隨著pH值的增加而增加，但是D-P5的熒光比率F510/F360沒有明顯的變化。這表明D-P5與Cd2+在pH>5時發(fā)生相互作用，這樣就明顯增強了FRET效應。這是由于Cys殘基側鏈-SH基團發(fā)生去質子化增加了負電荷所致[22]。而pH>7時，Cd2+易發(fā)生水解降低了其與D-P5的結合。當pH=7時，熒光比率F510/F360達到最大值，這說明在中性狀態(tài)下D-P5對Cd2+的檢測是最佳的。綜上，本實驗選用了pH=7的條件來對Cd2+進行定量分析。

圖6 pH值對D-P5和D-P5/Cd2+熒光比率(F510/F360)的影響Fig.6Effects of pH values on the fluorescence ratio (F510/F360)of D-P5 and D-P5/Cd2+system

2.4 Cd2+與D-P5的結合常數

通過計算Cd2+與D-P5的結合常數來評估D-P5與Cd2+的鍵合程度。結合常數的計算是基于Cd2+與D-P5作用的滴定曲線，通過以下方程擬合得到[31-32]。

其中，x為Cd2+的濃度，F0為無Cd2+時體系的熒光強度，F(x)為特定濃度下體系的熒光強度，F∞為所有的D-P5與Cd2+配位時的熒光強度，Ka為結合常數。

如圖7，以D-P5與Cd2+為2∶1的鍵合模式通過對510 nm處的熒光發(fā)射強度進行非線性最小二次方擬合分析，求得結合常數Ka為3.0×1011L2·mol-2。這說明D-P5和Cd2+有高的鍵合親和性，是由于DP5中2個Cys殘基的巰基與Cd2+形成穩(wěn)定的配位鍵所致。

圖7 熒光發(fā)射強度對Cd2+濃度的非線性最小二乘擬合曲線Fig.7Nonlinear least-squares fitting curve for emission intensity vs cCd2+

2.5 檢出限的確定

通過熒光比率和Cd2+濃度之間的線性關系計算D-P5的檢出限。圖8為D-P5傳感器對重金屬Cd2+檢測的靈敏度，以510和360 nm處的熒光比率(F510/F360)對Cd2+濃度作圖。當Cd2+濃度低于5 μmol· L-1時，隨著Cd2+濃度的增加熒光發(fā)射強度呈比例增加。通過計算得到其檢出限為11.5 nmol·L-1。比我們實驗室曾報道的檢測Cd2+的傳感器檢出限低[28]。

圖8 D-P5的熒光比率F510/F360對cCd2+作圖Fig.8Plot of fluorescent ratio F510/F360of D-P5 vs cCd2+

3 結論

通過Fomc固相合成法合成了一個新的多肽基熒光比率化學傳感器。利用熒光光譜研究了其與金屬離子的相互作用。結果表明，D-P5對Cd2+有很好的選擇性和靈敏性，它主要是基于Trp殘基和熒光基團Dansyl之間的熒光共振能量轉移機理來進行傳感的。D-P5與Cd2+相互作用形成2∶1的配合物，求得其結合常數為3.0×1011L2·mol-2。它能用于中性溶液中Cd2+的高靈敏度檢測，檢出限為11.5 nmol· L-1。

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A High Selective Fluorescent Ratio Sensor for Cd2+Based on the Interaction of Peptide with Metal Ion

WANG Zhao-LuFENG Hui-YunLI YanXU TaoXUE Ze-ChunLI Lian-Zhi＊
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252059,China)

A new fluorescent ratio chemosensor(Dansyl-Cys-Pro-Pro-Cys-Trp-NH2)for metal ions has been synthesized via Fmoc solid-phase peptide synthesis.The interactions of the peptide with metal ions were investigated by fluorescence spectroscopy.Results showed that it showed high selectivity toward Cd2+over other commonly coexistent metal ions.The peptide has the advantages of specific recognition to Cd2+,a good watersoluble and a fast response.The peptide tightly binds to Cd2+with the binding constant of 3.0×1011L2·mol-2and the detection limit of 11.5 nmol·L-1.

peptide;Cd2+;fluorescent chemosensor;fluorescent ratio;fluorescence resonance energy transfer

O614.24+2

A

1001-4861(2015)10-1946-07

10.11862/CJIC.2015.261

2015-01-11。收修改稿日期：2015-07-23。

山東省自然科學基金(No.ZR2011BL002)資助項目。

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