孫 靜，甄 毓，米鐵柱**

（1.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000）

長江是中國第一大河，研究長江干流的浮游植物生物多樣性具有重要意義。長江三峽水利樞紐工程（三峽工程）是世界上最大的水電水利樞紐工程，它的建成在產(chǎn)生巨大綜合效益的同時，也改變了生源要素的時空分布，使得浮游生物的組成和數(shù)量發(fā)生改變，進(jìn)而影響整個水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，對庫區(qū)、下游、乃至近海的生態(tài)與環(huán)境帶來了廣泛而深遠(yuǎn)的影響。

三峽大壩建成以后，長江水體原來的水文環(huán)境發(fā)生了巨大改變：庫內(nèi)水流變緩，透明度顯著升高，水體滯留時間大大延長，加上較高的營養(yǎng)鹽濃度更適宜藻類的生長，增加了藻華暴發(fā)頻率。因而，近年來，有關(guān)長江浮游植物分布特征的研究受到了越來越多的生態(tài)學(xué)家關(guān)注。但這些研究多專注于長江口及其臨近海域、三峽庫區(qū)［1－7］，而對整個長江干流水域的研究則較少［8－9］。本研究運用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），針對浮游植物18SrDNA基因，對2006年4及9月長江干流涪陵以下25個站位的浮游植物多樣性進(jìn)行了研究，對浮游植物的總體分布格局及其與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)域及樣品采集

2006年4 、9 月分別對長江干流的25個站位進(jìn)行樣品采集工作（采樣站位見圖1）。一部分水樣首先用200目的篩絹過濾，然后將過濾后的江水用0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，置于－20℃保存，用于浮游植物群落多樣性的分析。另一部分水樣用孔徑0.45μm的聚醚砜濾膜過濾（濾膜預(yù)先在1∶1 000HCl中浸泡48h以上，后用超純水清洗數(shù)遍，45℃烘干，備用），濾液裝于2個100mL聚乙烯瓶中（樣品瓶預(yù)先在1∶5HCl中浸泡48h以上，后用超純水清洗數(shù)遍，然后包上潔凈的塑料袋，備用），其中一份－20℃冷凍保存，用于測定硝酸鹽（NO3－N）、氨氮（NH4－N）、磷酸鹽（PO4－P）濃度；另一份加入1滴氯仿常溫避光保存，用于測定硅酸鹽（SiO3－Si）濃度。

1.2 DNA的提取

參照Sinha等［10］的方法并進(jìn)行改進(jìn)。用500μL TE緩沖液（10mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）懸浮藻細(xì)胞；加入600μL預(yù)熱到55℃的抽提緩沖液（3%CTAB，1%Sarkocyl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl，1% α-Mercaptoethanol），55℃處理60min；加入1mL氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），14 000r/min，4℃離心10min；小心取上清液，加入1/10體積的醋酸鈉（3mol/L，pH＝5.3）和2倍體積的冰冷無水乙醇，放置于－20℃使DNA沉淀2h，14 000r/min，4℃離心10min；70%乙醇洗滌2次；真空抽干，40μL TE緩沖液溶解。

1.3 PCR及瓊脂糖電泳檢測

PCR擴(kuò)增所用引物為真核生物通用引物F1427（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC-CCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG）和R1616（5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG）［11］。PCR擴(kuò)增程序為94℃，5min；94℃變性30s，52℃退火1min，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

圖1 長江干流2006年4月、9月樣品采集站位圖Fig.1 Sampling stations

將5μL擴(kuò)增的產(chǎn)物與1μL上樣緩沖液混合后上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1×TAE緩沖液中染色10～30min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.4 DGGE分析

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。DGGE電泳條件為：10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30%到55%，150V，1×TAE緩沖液中電泳8h。電泳完畢后，將凝膠置于0.5μg/mL溴化乙錠溶液中震蕩染色20min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 主要理化因子的測定

本研究所用硝酸鹽、氨氮、磷酸鹽、硅酸鹽濃度均利用AAIII型營養(yǎng)鹽自動分析儀（德國BRAN＋LUEBBE公司）進(jìn)行測定；懸浮顆粒物（SPM）的含量利用差重法測得。

1.6 圖像處理及數(shù)據(jù)分析方法

使用Quantity One軟件對圖像進(jìn)行處理。將圖像的背景扣除后，對條帶進(jìn)行自動檢測，然后手動進(jìn)行確認(rèn)?；贒GGE圖譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages，UPGMA）對各站位間的相似性進(jìn)行聚類分析。根據(jù)各條帶的亮度，運用以下公式計算Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（H）

式中：ni為每條帶的亮度峰值；N為每個泳道中所有條帶亮度峰值的和［12］。

利用Canoco軟件（version 4.51）進(jìn)行典范對應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA）以揭示物種多樣性和環(huán)境因子的關(guān)系［13］。主要過程為用automated forward selection method去除variance infla-tion factor（VIF）大于20的環(huán)境因子，利用 Monte Carlo permutation test（499permutations）選擇與物種組成顯著相關(guān)的環(huán)境變量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為230bp。從圖2可以看出，每個站位的DNA提取物經(jīng)PCR擴(kuò)增后均得到了一條特異性條帶。說明該對引物具有較好的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物適合用于DGGE分析。

2.2 DGGE分析結(jié)果

從DGGE電泳圖譜來看（見圖3），2006年4、9月份長江干流各觀測站均呈現(xiàn)較高的浮游植物多樣性：4月份各站位共呈現(xiàn)42條不同的條帶，各站位之間無共有條帶及特有條帶，豐都與鎮(zhèn)江浮游植物多樣性最低，DGGE條帶數(shù)為14，而巫山條帶數(shù)高達(dá)27，幾乎為豐都及鎮(zhèn)江的2倍；9月份各站位共39條不同條帶，僅有2條帶是各站位的共有條帶，浮游植物多樣性在各站位間的變化也比較顯著，條帶數(shù)介于11（涪陵）～26（大通）之間（見圖4）。除云陽鎮(zhèn)、南津關(guān)、大通和南京外，其余各采樣點4月份與9月份的浮游植物多樣性較為相近。

基于Dice相似系數(shù)，采用UPGMA聚類分析的方法，對4、9月份DGGE圖譜相似性進(jìn)行分析。從圖5可以看出，4月份各站位的聚類結(jié)果與9月份極為相似，基于各站位的物種組成聚類的結(jié)果很好地反應(yīng)了它們所屬站位的空間分布格局。4月份長江干流各站位聚為3類，3類站位分別位于三峽庫區(qū)、長江中下游及感潮河段。第一類又分為3個小的分支：涪陵、豐都、忠縣和萬州這4個站位均位于上游河段；云陽鎮(zhèn)、奉節(jié)、巫山和巴東4個站位位于三峽庫區(qū)的尾部；云陽、新灘鎮(zhèn)和香溪3個站位聚在一起，組成1個小的分支。第二類中的10個站位也分為3個小的分支：三斗坪（壩下）、南津關(guān)、葛洲壩下、荊州和監(jiān)利5個站位均緊鄰三峽大壩；洪湖、漢陽和黃石3個站位均位于洞庭湖的下游附近；城陵磯和安慶分別位于洞庭湖與鄱陽湖的出口。第三類群包括位于鄱陽湖下游的鎮(zhèn)江、大通、南京和江陰4個站位，DGGE圖譜相似性系數(shù)最高，說明這幾個站位所揭示的浮游植物多樣性最為相似（見圖5A）。

圖2 長江干流2006年4、9月浮游植物樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of phytoplankton samples from the Yangtze River in April and September 2006

圖3 長江干流2006年4、9月浮游植物樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）fingerprints of phytoplankton samples from the Yangtze River in April and September 2006

9月份各站位共聚為4類，其中4類中的3個類群基本和4月份相同，且各類群間的相似性高于4月份。與4月份所不同的是，涪陵與豐都2個采樣點單獨聚為一支，與其它各站位的相似性較低（見圖5B）。

2.3 CCA分析結(jié)果

首先用軟件Canoco進(jìn)行DCA分析，結(jié)果表明最大梯度值分別為2.554和2.022（＞2.0），且經(jīng)驗證，本研究中所有理化因子的VIF值均＜20，因此選擇典范對應(yīng)分析對4、9月份樣品進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步探討DGGE所揭示的物種多樣性和相關(guān)環(huán)境因子的關(guān)系（見圖6）。

圖4 2006年4月及9月各采樣點的DGGE圖譜條帶數(shù)Fig.4 Numbers of DGGE bands for each sampling station in April and September 2006

圖5 基于DGGE圖譜的UPGMA聚類分析結(jié)果Fig.5 Results of UPGMA cluster analysis based on DGGE patterns

第一軸反映的浮游植物組成與環(huán)境因子的相關(guān)性系數(shù)較高（見表1），分別為0.955（4月）和0.899（9月）；前兩軸的浮游植物組成與理化因子的特征參數(shù)累積變化率達(dá)到71.7%（4月）和71.9%（9月），說明浮游植物多樣性與本研究中所涉及的理化參數(shù)具有較好的相關(guān)性。表1中還列出了由CCA分析得到的各環(huán)境因子與前兩軸的相關(guān)系數(shù)?？梢钥闯?，硅酸鹽與2個月的浮游植物組成具有較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.770 2（4月）和0.863 2（9月）。4月份浮游植物組成還與懸浮顆粒物相關(guān)性較強(qiáng)，懸浮顆粒物與第一軸的相關(guān)系數(shù)僅次于硅酸鹽，為0.746 7；而氨氮則與9月份浮游植物組成相關(guān)性較強(qiáng)，與第一軸相關(guān)系數(shù)為－0.717 0。此外，磷酸鹽和懸浮顆粒物分別在4和9月份的浮游植物組成中也起著重要作用，與第二軸的相關(guān)性系數(shù)較大?？梢姡珻CA分析能夠很好地反映浮游植物多樣性與理化因子的關(guān)系。

3 討論

本研究運用DGGE技術(shù)對2006年平水期（4月）及豐水期（9月）長江干流的浮游植物多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，4與9月各站位的條帶數(shù)差異并不大，各站位間的共有條帶很少，說明整個長江干流浮游植物類群存在較大的差異，浮游植物種類較為豐富。9月份大多數(shù)站位的浮游植物種類要多于4月份；位于庫區(qū)的站位與其它站位相比，浮游植物種類并未呈現(xiàn)明顯偏高的趨勢。

圖6 環(huán)境變量與DGGE揭示的物種區(qū)域多樣性的CCA分析Fig.6 Canonical correspondence analysis biplot of species regional differences revealed by DGGE fingerprints constrained to environmental variables

表1 CCA分析結(jié)果總結(jié)Table 1 Summary results of the canonical correspondence analysis

DGGE技術(shù)在對微生物多樣性研究中的有效性已經(jīng)得到了很好的印證［14－16］，而利用這一技術(shù)對浮游生物時空分布研究尚不多見：Yan等［17］運用DGGE技術(shù)對東湖的浮游生物群落多樣性進(jìn)行了研究，Sun等［18］對東黃海浮游植物的分布進(jìn)行了研究；研究結(jié)果均表明浮游生物群落組成的DGGE圖譜可以很好地反映其相應(yīng)的生態(tài)環(huán)境。在本研究中，基于各站位浮游植物組成進(jìn)行聚類的結(jié)果與它們在長江干流的分布格局基本是一致的（見圖5）。4月份，各個站位共聚為3大類，三類站位分別位于三峽庫區(qū)，長江中下游及感潮河段。其中第一類又分為3個小的分支：涪陵，豐都，忠縣和萬州均位于上游河段，此處的生態(tài)環(huán)境更接近于自然江段；云陽鎮(zhèn)，奉節(jié)，巫山和巴東4個站位位于三峽庫區(qū)的尾部，由于三峽庫區(qū)2006年蓄水至156m，此處的水位已有抬高，流速減慢，為浮游植物提供了有利的生長環(huán)境；云陽，新灘鎮(zhèn)和香溪3個站位處的水位也被抬高，但同時均有小的支流匯入，導(dǎo)致這里的浮游植物群落發(fā)生了變化，并且在采樣期間發(fā)現(xiàn)有水華的發(fā)生，所以這3個站位在聚類分析時聚為一支。第二類中的10個站位也分為3個小的分支：三斗坪（壩下），南津關(guān)，葛洲壩下，荊州和監(jiān)利5個站位均位于三峽大壩的下游，經(jīng)過大壩的截留效應(yīng)，使這里的水文特征不同于上游河段，具有了自己較為獨特的浮游植物組成；洪湖，漢陽和黃石位于洞庭湖的下游，這幾個站位的江面比較開闊，流速緩慢，更有利于浮游植物的生長；而城陵磯和安慶分別位于洞庭湖與鄱陽湖的下游，由于與2湖的距離較近，2個站位受2湖的影響較為顯著，此處的浮游植物部分來自于2湖，故2個站位具有更多的相似性。而9月份聚類分析的結(jié)果與4月份略有不同，涪陵與豐都獨自聚為一支，與其它站位的相似性較低，初步推測可能是由于9月份過高的懸浮顆粒物濃度所致（見圖7）。對于長江而言，泥沙等懸浮物是影響水體透明度的主要因素，而水體的透明度直接影響了浮游植物的生長。此外，9月份長江處于豐水期，徑流量大，此時在4月份受兩湖影響比較顯著的城陵磯和安慶2個站位在聚類分析時不再聚為一類。由聚類分析的結(jié)果表明，DGGE技術(shù)可以有效地對長江干流的浮游植物多樣性進(jìn)行研究，各站位的物種組成聚類的結(jié)果很好地反映了它們所屬站位的空間分布格局。根據(jù)2004年7—8月（雨季）和2005年5月（旱季）長江各站點的浮游植物生物量和主要營養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)做聚類分析［19］，由雨季的聚類分析結(jié)果表明，所有站點可以分成2類，中下游從洪湖到江陰為一類，而涪陵到中游的監(jiān)利為一類，與本研究具有較高的一致性，說明浮游植物基本上是按照其所屬環(huán)境格局進(jìn)行分布；而在旱季各站點可以歸為3類，沒有較為顯著的分布特征，與本研究有一定差異。導(dǎo)致這種差異性的主要原因可能是：2研究所采用的方法不同，由于傳統(tǒng)的檢測生物量的方法與分子生物學(xué)方法具有不同的靈敏度，進(jìn)而會導(dǎo)致實驗結(jié)果的差異；此外，研究的站位及調(diào)查取樣的時間不同，也會導(dǎo)致分析結(jié)果的偏差?？傊贒GGE圖譜的聚類分析結(jié)果得到的浮游植物的區(qū)域分布，反映了各類群所屬海域的環(huán)境特征，PCR-DGG技術(shù)在該水域的浮游植物群落區(qū)域性分布研究中取得了很好的結(jié)果。

圖7 2006年4月及9月長江干流懸浮顆粒物的沿程分布Fig.7 The distribution of SPM concentrations in the Yangtze River in April and September 2006

在CCA分析結(jié)果的雙序圖中，清楚地看出各站位浮游植物對于不同生態(tài)環(huán)境的要求，并且對環(huán)境條件要求相近的站位在圖中的位置較為接近。環(huán)境因子用帶有箭頭的線段（矢量）表示，箭頭連線與排序軸的夾角表示該環(huán)境因子與排序軸相關(guān)性的大小，箭頭所指的方向表示該環(huán)境因子的變化趨勢［13］。本研究中，CCA分析結(jié)果的雙序圖表明了各環(huán)境因子對各站位的影響（見圖6A）：4月份組Ⅰ主要是受懸浮顆粒物和硅酸鹽的影響，組Ⅲ受氨氮的影響比較顯著，而組Ⅱ與本研究中所涉及到的理化因子的相關(guān)性均較小。從圖6B中可明顯看出9月份各站位與環(huán)境因子的相關(guān)性：組Ⅰ與硅酸鹽有較強(qiáng)的正相關(guān)，組Ⅱ主要受氨氮的影響，與之呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性。此外，2個月份的CCA雙序圖表明，涪陵，豐都2個站位均受懸浮顆粒物的影響較大。在本次調(diào)查期間，2個月份的浮游植物群落組成均與硅酸鹽的相關(guān)性較強(qiáng)。Yan等［3］運用DGGE技術(shù)對2006年4月份位于三峽庫區(qū)10個站位（香溪河及長江干流各5個）的真核浮游生物的研究，也表明了硅酸鹽這一理化因子的重要性。

浮游植物沒有或僅有微弱的運動能力，主要是隨波漂流。因此，水流對其分布有著重要影響。長江是一個處于動態(tài)的水體，水流必然在浮游植物的組成中起著重要作用。但在本研究中，由于缺乏流速的數(shù)據(jù)，未能將其納入CCA的分析當(dāng)中，因而可能會導(dǎo)致分析結(jié)果的某些偏差。有關(guān)研究表明，長江干流浮游植物的數(shù)量及生物量與營養(yǎng)鹽無顯著的相關(guān)性，決定長江干流浮游植物數(shù)量及生物量的是水文條件（主要是干流的水動力因素），并且長江干流硅酸鹽的含量與水流量有著顯著的正相關(guān)［19］。因此，懸浮顆粒物、硅酸鹽與銨鹽有可能是受長江干流的水文條件的影響比較顯著，從而與浮游植物表現(xiàn)相似的變化規(guī)律，而并非與浮游植物的組成具有直接的因果關(guān)系。事實上，這種由于水文條件而決定浮游植物的數(shù)量及生物量的現(xiàn)象，在世界其它河流中也有報道［20－21］。

分子生物學(xué)方法在研究浮游生物多樣性方面具有其它方法無法比擬的靈敏性［17］，比起其它生物學(xué)方法，更適合用于細(xì)菌以及浮游生物等的分析［22］，基于18S rDNA的DGGE技術(shù)在本研究中亦取得了很好的研究結(jié)果。在本次調(diào)查期間，硅酸鹽、懸浮顆粒物和氨氮對浮游植物組成的影響較為明顯，但是由于長江徑流量的年際變動，影響浮游植物組成的理化因子也會有所不同。因此，要想獲得更加詳盡的結(jié)果，需要進(jìn)一步的現(xiàn)場調(diào)查及探索。此外，由于不同的方法具有不同的靈敏度，基于形態(tài)學(xué)特征等的其它研究方法與本研究結(jié)果可能會存在一些差異，多種方法相互補(bǔ)充，會取得更加全面的分析結(jié)果。

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