周海英，許云敏，余麗萍，杜 艷，單 斌，陳正輝，邵天波，陳瑞春

重癥監(jiān)護室（ICU）是醫(yī)院感染高發(fā)病區(qū)，而新生兒ICU（NICU）因患兒年齡小，起病急、病情變化快，其特異性和非特異性免疫功能尚不成熟，抵抗力差，如果再并發(fā)醫(yī)院感染，將直接危及到患兒的生命，因此控制醫(yī)院感染，對提高新生兒存活率顯得尤為重要。連續(xù)性耐藥監(jiān)測對臨床用藥具有重要意義，可以指導和幫助臨床合理選擇抗菌藥物，并可及時發(fā)現(xiàn)病房內細菌耐藥暴發(fā)流行的狀況，早期發(fā)現(xiàn)耐藥因素，為制定抗菌藥物使用指南提供依據(jù)［1-2］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與分離鑒定 收集昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2010—2013 年NICU 分離出的648株腸桿菌科細菌，排除同一患兒同一部位重復株。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗菌藥物紙片 藥敏試驗的培養(yǎng)基為MH 瓊脂（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。藥敏試驗紙片為英國OXOID公司產品，全自動藥敏試驗卡片為VITEK-2檢測系統(tǒng)配套產品（法國生物梅里埃公司）。受試抗菌藥物見結果部分表格所列。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定 采用VITEK-2配套GN 卡進行細菌種類的鑒定。

1.2.2 藥敏試驗 主要采用VITEK-2 配套藥敏卡進行測定，部分補充的藥物采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的紙片擴散法。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853。每周進行1次質控。

1.2.3 判斷標準和統(tǒng)計分析 藥敏試驗按CLSI 2012年版標準［3］判斷結果，采用WHONET5.6軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 標本分布

4年間標本分布基本相同，主要以尿液、呼吸道及血液標本為主，平均分別占51.2%（332／648）、30.6%（198／648）、15.1%（98／648），其他標本占3.1%。見表1。

表1 2010—2013年送檢標本數(shù)的分布Table 1 Distribution of specimen types by year n （%）

2.2 菌株分布

4年間細菌菌種分布無明顯改變，主要以大腸埃希菌、克雷伯菌屬（肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌和解鳥氨酸克雷伯菌）和腸桿菌屬（陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌）為主，平均檢出率分別為47.4%（307／648）、38.1%（247／648）、10.3%（67／648），其他腸桿菌科細菌所占比例4.2%（27／648）。見表2。

2.3 細菌對藥物敏感性

總體顯示細菌對阿米卡星敏感率最高，平均為95.7%；對碳青霉烯類抗生素保持較高敏感率，對美羅培南、厄他培南和亞胺培南的敏感率分別為92.3%、90.9%和87.6%；對青霉素類、頭孢菌素類抗生素耐藥率較高，除對頭孢吡肟和頭孢他啶敏感率分別為72.7%、56.2%外，其余均低于30.0%；對喹諾酮類的敏感率在79.2%～87.1%。連續(xù)監(jiān)測顯示，所檢測的抗菌藥物敏感率在2011年均有所下降。對第三代頭孢菌素的敏感率無明顯變化，趨于平穩(wěn)，對頭孢吡肟敏感率有所上升（72.6% 到86.5%）；對頭孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦敏感率逐漸下降，前者從82.8%到61.9%，后者從87.9%到82.1%；對阿莫西林-克拉維酸敏感率升高（18.4%到51.8%）；喹諾酮類左氧氟沙星敏感率逐漸升高（62.5%到93.1%），總敏感率為87.1%，環(huán)丙沙星總敏感率為79.2%。見表3。

表2 2010—2013年前3位細菌的檢測率Table 2 Top three Enterobacteriaceae species and number of strains during the period from2010 to 2013 n （%）

表3 648株腸桿菌科細菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of 648 strains of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents （%）

2.4 腸桿菌科3個常見菌種的耐藥變遷

2.4.1 大腸埃希菌 大腸埃希菌307株，占檢出的第1位。對碳青霉烯類抗生素敏感率最高，其次是阿米卡星，兩者敏感率均大于93.0%；對頭孢曲松和頭孢噻肟敏感率低于頭孢他啶，對頭孢哌酮-舒巴坦敏感率呈下降趨勢（84.9%降到70.1%），對哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉維酸的敏感率呈上升趨勢，分別從89.1%升至97.1%，22.6%升至65.6%，對其他抗菌藥物敏感率與腸桿菌科總變遷相同。見表4。

表4 2010—2013大腸埃希菌對抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of Escherichia coli to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

2.4.2 克雷伯菌屬 共分離247株。對阿米卡星的敏感率與大腸埃希菌相似，保持在94%以上；對碳青霉烯類、頭孢菌素類的敏感率低于大腸埃希菌；對喹諾酮類敏感率高于大腸埃希菌；對頭孢曲松和頭孢噻肟敏感率與大腸埃希菌一樣，低于頭孢他啶；對慶大霉素（從78.9%降到59.4%）、頭孢哌酮-舒巴坦（81.2%降到51.6%）、哌拉西林-他唑巴坦（83.8%降到68.4%）敏感率逐年下降，對其他抗菌藥物敏感率變遷與腸桿菌科總變遷相同。藥敏結果見表5。

2.4.3 腸桿菌屬 共分離67 株。由于2012 和2013年菌株數(shù)少，僅對2010和2011年菌株進行分析。對阿米卡星、碳青霉烯類的3種抗生素和阿莫西林-克拉維酸敏感率都低于大腸埃希菌和克雷伯菌屬；對其余大部分抗菌藥物敏感率高于大腸埃希菌和克雷伯菌屬。藥敏結果見表6。

2.5 產和非產超廣譜β內酰胺酶（ESBL）株的藥敏結果

共檢出產ESBL 的菌株277 株，占腸桿菌科42.7%。ESBL檢出率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。大腸埃希菌、克雷伯菌屬中產ESBL 株平均分別為46.3%（142／307）和54.7%（135／247）。產ESBL 的大腸埃希菌對大部分抗菌藥物的敏感率低于非產ESBL菌株；但克雷伯菌屬產ESBL菌株除對頭孢曲松、頭孢噻肟及哌拉西林的敏感率低于非產ESBL株外，對碳青霉烯類，含酶抑制劑類抗菌藥物的敏感率卻高于非產ESBL菌株，其余抗菌藥物未見明顯差異。見表7。

2.6 碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）

在NICU 共分離到產碳青霉烯酶菌株51株，占腸桿菌科細菌的7.9%。改良Hodge試驗陽性48株，陰性3株?？死撞鷮?7株（72.5%），其中肺炎克雷伯菌33株（64.7%）；腸桿菌屬9株（17.6%），其中陰溝腸桿菌8株（15.7%）；弗勞地枸櫞酸桿菌3株（5.9%）；大腸埃希菌2株（3.9%）。該類菌株對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為83.7%、60.5%、95.3%。對頭孢菌素類耐藥率較高，除對第四代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率為61.0%外，其余第一、二、三代頭孢菌素及含酶抑制劑類抗菌藥物的耐藥率均＞90%；對氨曲南的耐藥率為46.2%，對氨基糖苷類抗生素耐藥率較低，均＜30%，其中對阿米卡星的耐藥率僅為2.6%；對喹諾酮類藥物有較高的體外敏感性，耐藥率＜10%，48株細菌均未發(fā)現(xiàn)對左氧氟沙星耐藥。藥敏結果見表8。

表5 克雷伯菌屬對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of Klebsiellaspp.to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

表6 腸桿菌屬對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterobacter spp.to antimicrobial agents by year from2010 to 2013 （%）

表7 產與非產ESBL的大腸埃希菌和克雷伯菌屬對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 7 Susceptibility of ESBLs（＋）and ESBLs（-）E.coli and Klebsiellaspp.to antimicrobial agents （%）

表8 CRE對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 8 Susceptibility of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains to antimicrobial agents （%）

3 討論

本研究2010—2013 年耐藥監(jiān)測結果如下：①NICU 分離到的腸桿菌細菌主要來源于泌尿道，其次為呼吸道和血液標本。分離細菌以大腸埃希菌、克雷伯菌屬和腸桿菌屬為主，與國內報道基本相同［4］。4年間標本來源及常見菌分布基本相同。②腸桿菌科細菌對阿米卡星敏感率最高，其次為碳青霉烯類抗生素。各類抗菌藥物對大腸埃希菌敏感性高于克雷伯菌屬和腸桿菌屬，其原因與產碳青霉烯酶的腸桿菌細菌以克雷伯菌屬（肺炎克雷伯菌）和腸桿菌屬（陰溝腸桿菌）為主有關。除了克雷伯菌屬外，大腸埃希菌和腸桿菌屬對大部分受試藥物的敏感率高于全國ICU 的報道［5］，大腸埃希菌和克雷伯菌屬對環(huán)丙沙星和慶大霉素的敏感率與王麗等［6］報道相近；兒童耐藥率低于成人［7］，可能與喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物在NICU 較少應用有關。③產ESBL 菌株檢出率逐年升高，大腸埃希菌和克雷伯菌屬的ESBL 檢出率平均分別為46.3%、54.7%；大腸埃希菌ESBL 檢出率低于昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2013年57.4%以及全國2012年55.3%水平［4］；而克雷伯菌屬高于昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2013年33.7%和全國2013年33.9%水平［4］。有研究報道，兒科ESBL 檢出率高于成人科室［8］。大腸埃希菌產ESBL菌株對大多數(shù)抗菌藥物的敏感率低于非產ESBL 菌株；但克雷伯菌屬產ESBL菌株對碳青霉烯類抗生素的敏感率顯著高于非產ESBL 菌株，這一現(xiàn)象與昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院NICU 中CRE 菌株主要以克雷伯菌屬為主有關。CRE 的產生是否會導致儀器對ESBL 的檢測發(fā)生了錯誤？針對這一問題我們對43株CRE菌株進行了ESBL 表型確證試驗，結果顯示僅有5株（12%）的表型確證試驗為陽性。因此，在本文中并未對相關的結果進行修正，仍以原測定結果進行統(tǒng)計分析。針對表7中大腸埃希菌和克雷伯菌ESBL陰性菌株數(shù)，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院目前使用的藥敏卡片有AST-GN14 及AST-GN09 卡，由 于在日常工作中存在檢測人員經(jīng)驗不足等情況，導致有些侏儒型和不利用乳糖的大腸埃希菌及部分不典型克雷伯菌會使用AST-GN09 進行藥敏檢測；ESBL 現(xiàn)在不作為常規(guī)耐藥監(jiān)測，對于未做ESBL檢測的大腸埃希菌及克雷伯菌株沒有進行手工紙片擴散法復核，導致ESBL陰性菌株數(shù)有一定的差異。

最近10 余年，CRE 菌株在全世界范圍出現(xiàn)并流行［9-11］。據(jù)英國抗生素耐藥監(jiān)測及參考實驗室（ARMRL）的數(shù)據(jù)顯示，2010年產碳青霉烯酶細菌較2003年增長了近300 倍［12］。中國CHINET 顯示2005年對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為2.9%和2.8%，2011年分別為9.3%和9.4%［13］。但兒童特別是新生兒患者鮮見報道［14］。我國臨床分離的腸桿菌科細菌主要產KPC-2 型碳青霉烯酶［11］。董方等［15］研究表明，兒科患者對碳青霉烯類不敏感腸桿菌科細菌中，imp 基因陽性占82.6%。

產ESBL菌株逐年升高，CRE 菌株不斷出現(xiàn)，應進行流行病學調查，查明感染源和傳播途徑，采取有效的感染控制措施防止耐藥菌感染在病房中流行，避免引起全院范圍播散，已刻不容緩。

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