羅曉波，齊良富，耿研會

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川成都 610000;2.瀘定縣林業(yè)工業(yè)總公司，四川瀘定 626101 3.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610000)

百合是著名觀賞花卉，中國是百合植物資源的自然分布中心，全世界百合屬植物約100種，其中中國原產(chǎn)47種，種類豐富，珍稀特有種多［1］。宜昌百合為我國特有種，自然分布于四川北部廣元及川東地區(qū)，因模式標(biāo)本由Baker采自湖北宜昌，故名。其花清香怡人，具有極高的觀賞價(jià)值，加之抗病能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，也是很好的育種材料。2005年，王祎對宜昌百合進(jìn)行了小鱗莖誘導(dǎo)的初步研究［2］。2007年，熊丹、薛曉娜對宜昌百合開展了組織培養(yǎng)研究［3～4］。為了加快宜昌百合的開發(fā)利用，作者對野生宜昌百合進(jìn)行了離體培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，取得了較好進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

野生宜昌百合(L.leucanthum)種球采自四川省廣元市朝天區(qū)境內(nèi)，栽種于四川師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體預(yù)處理

取野生宜昌野生百合內(nèi)層鱗片，自來水洗凈泥土與雜質(zhì)，在低濃度洗衣粉溶液中浸泡10 min，流動水不斷沖洗，在超凈工作臺上將清洗后的百合鱗片置入70%酒精溶液內(nèi)，輕輕搖動30 s，無菌水沖洗3次，加入0.1%升汞溶液，浸泡消毒1 min，用無菌水清洗3次，用解剖刀將鱗片切成基部、中部、頂部3個(gè)部分(約1.0 cm2)，將處理好的外植體接種到初代培養(yǎng)基上，每瓶接種1塊～2塊。培養(yǎng)第42天統(tǒng)計(jì)生長情況。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS添加不同濃度的6-BA、IBA和 NAA(參見表1)，并加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH 值為 6.0。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26℃，光照強(qiáng)度1 500 lx～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.3 野生宜昌百合不定芽的增殖

增殖培養(yǎng)基為:MS添加不同濃度的6-BA和NAA(見表2)，并加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH值為6.0。培養(yǎng)條件為:溫度24℃，光照強(qiáng)度1 500 lx～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

表2 激素質(zhì)量濃度及組合對野生宜昌百合愈傷組織和不定芽增殖的結(jié)果Tab.2 Results of hormone combination and concentration on propagating wild whiteflower lily callus and adventitious buds

1.2.4 野生宜昌百合的生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)基為:1/2MS添加1.5 g·L-1活性炭(AC)和不同濃度的NAA或6-BA(見表3)，并加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH 值為 6.0。培養(yǎng)條件為:溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度1 500 lx～2 000 lx，光照時(shí)間 12 h·d-1。

表3 不同激素種類及濃度對野生宜昌百合生根的結(jié)果Tab.3 Results of different kinds and concentrations of hormone on wild whiteflower lily rooting

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

對試驗(yàn)所得原始數(shù)據(jù)求其平均數(shù)，即為試驗(yàn)結(jié)果。采用以下公式進(jìn)行計(jì)算:

不定芽誘導(dǎo)率/%=(分化不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%，

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=(分化愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%，

不定芽增殖倍數(shù)=統(tǒng)計(jì)的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

生根率=(生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%，

根長平均值=(所有根的總長度/根的總數(shù))×100%。

式中:接種的外植體數(shù)不包括接種后被污染的外植體。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生宜昌百合鱗片不定芽和愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 激素濃度及其組合對鱗片愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響

由表1可見，6種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)野生宜昌百合鱗片產(chǎn)生不定芽，但不定芽誘導(dǎo)率存在明顯差異;當(dāng)1.5mg·L-16-BA 和0.2 mg·L-1NAA 配合使用(3號培養(yǎng)基)時(shí)，不僅不定芽誘導(dǎo)率最高，為86.67%，而且，愈傷組織的發(fā)生率也最高，為90.00%。觀察發(fā)現(xiàn)，在3號培養(yǎng)基中，第7天鱗片轉(zhuǎn)綠，第11天有小突起形成;在6號培養(yǎng)基中外植體在第10天時(shí)轉(zhuǎn)綠。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，4，1，2，6號培養(yǎng)基上的外植體陸續(xù)出現(xiàn)小突起，隨后發(fā)育成不定芽。因此，在供試培養(yǎng)基中，以MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA(3號培養(yǎng)基)最適合野生宜昌百合鱗片的不定芽誘導(dǎo)。

2.1.2 野生宜昌百合鱗片部位對不定芽誘導(dǎo)的影響

采用3號培養(yǎng)基，分別接種鱗片的上、中、基部切塊，誘導(dǎo)不定芽。對于所得結(jié)果，先用體視鏡觀察其外部形態(tài)，再用石蠟切片技術(shù)觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖1)。結(jié)果顯示，鱗片分化不定芽的能力為基部＞中部＞上部。因此，應(yīng)選擇與鱗莖盤相連的基部鱗片誘導(dǎo)不定芽。

圖1 顯微鏡觀察鱗片不同部位誘導(dǎo)的野生宜昌百合體細(xì)胞胚(A，C為基部，B，D為中部)Fig.1 Microscopic observation of somatic embryos in different parts of wild whiteflower lily bulb induction(A，C base，B，D as the central)

2.2 野生宜昌百合不定芽的增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同激素配比，作為增殖培養(yǎng)基的篩選。第30天統(tǒng)計(jì)不定芽增殖情況，結(jié)果見表2。在增殖培養(yǎng)基中添加的NAA濃度相同時(shí)，分別將6-BA的濃度分別設(shè)定為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1和 2.0 mg·L-1，發(fā)現(xiàn)在添加 1.0 mg·L-16-BA的增殖培養(yǎng)基中不定芽的增殖倍數(shù)最大，且不定芽生長健壯，葉片濃綠。因此，以添加1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基增殖效果最好。

2.3 野生宜昌百合的生根培養(yǎng)

野生宜昌百合初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及出芽生根情況見圖2。將增殖的不定芽接種于6種生根培養(yǎng)基中，第20天統(tǒng)計(jì)生根情況，結(jié)果見表3。從表3可知，在添加 0.5 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1IBA 或0.2 mg·L-1IBA的生根培養(yǎng)基中的生根率均為100%。在添加0.2 mg·L-1IBA的生根培養(yǎng)基中根的平均長度和根數(shù)的平均值都比較小;在添加0.5 mg·L-1NAA的生根培養(yǎng)基中產(chǎn)生的根數(shù)的平均值最大，但根長平均值較小。可見，添加0.5 mg·L-1IBA的生根培養(yǎng)基更適合野生宜昌百合的生根培養(yǎng)。

圖2 百合鱗片誘導(dǎo)愈傷組織的分化Fig.2 The differentiation of callus induction of lily scales

3 討論

3.1 激素濃度及其組合對野生宜昌百合鱗片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響

本研究結(jié)果表明，鱗片誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽的適宜培養(yǎng)基為 MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA。薛曉娜［4］等在秦嶺野生宜昌百合的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)鱗片誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，葉片誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-12，4-D，推測兩項(xiàng)研究結(jié)果差異的原因有二:一是研究條件的設(shè)置不同，二是外植體的差異。

3.2 激素濃度及其組合對野生宜昌百合愈傷組織及不定芽增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)篩選的野生宜昌百合愈傷組織及不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，對愈傷組織和芽的增殖倍數(shù)為5.05，結(jié)果明顯高于其它組合。而且，不定芽生長健壯。李筱帆等在幾種百合組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)的研究中得出:蘭州百合鱗片最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1，芽增殖倍數(shù)為4.04，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。原因可能是培育兩種百合的親本具有較近的親緣關(guān)系，兩品種的形成是繁育條件的不同所致，但其在遺傳上仍保留有一定的相似性。

3.3 激素IBA、NAA對野生宜昌百合生根的影響

劉靜［6］等在蘭州百合快速繁殖研究中得出最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1IBA。王剛等人以野百合鱗莖為外植體進(jìn)行愈傷組織及快速繁殖研究，最終得出的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.15 mg·L-1NAA+0.1%活性炭。這些與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相較，均有出入。根據(jù)柳玉晶［7］等對百合愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的研究，可以發(fā)現(xiàn)同為MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，加入0.5 mg·L-1IBA比不加此濃度激素時(shí)東方百合愈傷組織再生苗的生根率高，同時(shí)得出最適生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1IBA。由此可見，百合的品種、激素的種類、濃度及培養(yǎng)基的類型對百合的生根都有不同程度的影響。

［1］張?jiān)?，原雅玲，劉青?百合品種改良與生物技術(shù)研究進(jìn)展［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23(6):56～59.

［2］王祎，楊萬年.宜昌百合小鱗莖誘導(dǎo)的初步研究［J］·氨基酸和生物資源，2005，27(3):7～8.

［3］熊丹，陳發(fā)菊，梁宏偉，等.宜昌百合的組織培養(yǎng)研究［J］.福建林業(yè)科技，2007，34(4):91～97.

［4］薛曉娜，張延龍，牛立新.秦嶺野生宜昌百合的組織培養(yǎng)研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，35(6):108～112.

［5］孫安妮，張延龍，牛立新，等.宜昌百合體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及植株再生［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20(8):142～146.

［6］劉靜.蘭州百合快速繁殖研究［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2011，42(8):839～842.

［7］柳玉晶，龔束芳，樊金萍，等.百合愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2007，38(3):352～355.