黃斯瑜 鐘麗玲

廣州血液中心增城市血站，廣東增城 511300

亞甲藍(lán)光化學(xué)療法病毒滅活新鮮冰凍血漿在廣州增城地區(qū)的臨床應(yīng)用可行性

黃斯瑜 鐘麗玲

廣州血液中心增城市血站，廣東增城 511300

目的 通過(guò)檢測(cè)新鮮冰凍血漿病毒滅活前后Ⅷ因子含量及病毒滅活效果的變化，探討病毒滅活新鮮冰凍血漿在增城地區(qū)臨床應(yīng)用的可行性。 方法 將300袋未滅活新鮮冰凍血漿作為對(duì)照組，進(jìn)行Ⅷ因子含量檢測(cè)；將病毒滅活后上述300袋新鮮冰凍血漿作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行Ⅷ因子含量檢測(cè)，計(jì)算病毒滅活后Ⅷ因子含量。將5袋確診HBV和5袋確診HCV的新鮮冰凍血漿采用熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)亞甲藍(lán)光化學(xué)療法病毒滅活前后，病毒滅活效果的變化。臨床隨機(jī)抽取 200例輸注病毒滅活血漿的患者，觀察病毒滅活血漿輸注后是否出現(xiàn)輸血不良反應(yīng)。 結(jié)果 新鮮血漿病毒滅活前后血漿Ⅷ因子含量為（1.097±0.047）IU/mL、（0.824±0.027）IU/mL；凝血因子Ⅷ含量滅活前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；利用亞甲藍(lán)光化學(xué)療法血漿病毒滅活技術(shù)對(duì)凝血因子Ⅷ含量有一定的影響，但是均達(dá)到GB 18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》對(duì)病毒滅活新鮮冰凍血漿的質(zhì)量要求。標(biāo)本病毒滅活后血漿HBV-DNA及HCV-RNA載量均為＜1000copies/mL。病毒滅活血漿輸注人體后無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。 結(jié)論 臨床使用較安全，病毒滅活新鮮冰凍血漿能夠有效降低經(jīng)輸血傳播疾病的危險(xiǎn)性，且不良反應(yīng)較小。在廣州增城地區(qū)的臨床應(yīng)用是可行的。

亞甲藍(lán)光化學(xué)療法；病毒滅活；新鮮冰凍血漿

新鮮冰凍血漿是從無(wú)償獻(xiàn)血者采集血液于6～8h內(nèi)分離速凍而來(lái)，幾乎含有所有的血液凝血因子，臨床主要應(yīng)用于單種凝血因子缺乏、多種獲得性凝血因子缺乏、大量輸血伴凝血功能障礙、血栓性血小板減少性紫癜、C1-脂酶抑制物缺乏癥、溶血性尿毒綜合征的血漿轉(zhuǎn)換等，是臨床常用血液制品之一。輸血的安全性也越來(lái)越受到公眾的關(guān)注。本血站作為廣州增城地區(qū)的唯一供血單位，雖然對(duì)獻(xiàn)血者都進(jìn)行了篩選，但由于檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)技術(shù)等方面的局限，經(jīng)血傳播疾病還無(wú)法完全避免，血漿病毒滅活技術(shù)作為阻斷經(jīng)血傳播的疾病，有著不可代替的作用。亞甲藍(lán)（MB）光化學(xué)療法作為現(xiàn)階段最常用的血漿病毒滅活技術(shù)[1]其原理是，亞甲藍(lán)（MB）作為一種光敏劑，與可見(jiàn)光協(xié)同作用產(chǎn)生單態(tài)氮，后者可作用于核酸鏈上的鳥(niǎo)嘌呤，引起脫嘌呤和核酸鏈的斷裂和堿基位點(diǎn)丟失從而阻止其復(fù)制，由于亞甲藍(lán)光敏染料易穿透脂包膜病毒外殼并與病毒核酸結(jié)合，而非脂包膜病毒的病毒核酸結(jié)構(gòu)被衣殼緊密包裹，亞甲藍(lán)不易與其結(jié)合，這就解釋了為何大多數(shù)非脂包膜病毒不能被亞甲藍(lán)滅活的道理[2]。HBV、HCV、HIV病毒都屬于包膜病毒，通過(guò)應(yīng)用亞甲藍(lán)/光化學(xué)法對(duì)血漿中病毒進(jìn)行有效地滅活的方法對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血制備血漿進(jìn)行病毒滅活處理，使用病毒滅活血漿可有效控制經(jīng)血傳播疾病的傳播 ，保證臨床輸血的安全。

1 材料與方法

1.1 材料

一次性血漿病毒滅活過(guò)濾器（上海血液技術(shù)公司），百級(jí)凈化間，SE250型高頻熱合機(jī)（深圳達(dá)科為醫(yī)療器械有限公司，大容量低溫離心機(jī)（日立CR7）；醫(yī)用病毒滅活箱（上海通用機(jī)械集團(tuán)）；半自動(dòng)血凝儀（法國(guó)Stago公司），Ⅷ因子測(cè)定試劑（法國(guó)思達(dá)高診斷公司）。ABI7500fast熒光PCR儀（廣州血液中心臨床研究所），HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑（中山大學(xué)達(dá)因股份有限公司），HCVRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑（中山大學(xué)達(dá)因股份有限公司）。

1.2 調(diào)查對(duì)象

隨機(jī)抽取增城市血站2014年1～8月無(wú)償獻(xiàn)血300人份。本站采集的無(wú)償獻(xiàn)血者血液經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)HBV為陽(yáng)性5袋，HCV陽(yáng)性5袋。

1.3 方法

1.3.1 新鮮冰凍血漿制備 采集無(wú)償獻(xiàn)血者400mL全血后，6h內(nèi)4℃，4036g離心15min，將血漿轉(zhuǎn)移入血漿袋，制成新鮮冰凍血漿。

1.3.2 亞甲藍(lán)病毒滅活 把血漿與一次性病毒滅活輸血過(guò)濾器相連接，讓血漿在MB元件中停留1min，并將其進(jìn)行均勻混合，使之充分反應(yīng)，然后將血漿再流入光照袋，在32 000 ～ 38 000Lx光照強(qiáng)度的可見(jiàn)光在4℃溫度下照射35min，然后再將光照后的血漿通過(guò)病毒滅活過(guò)濾器濾除MB和殘留白細(xì)胞。全過(guò)程在6～8h內(nèi)完成。

1.3.3 新鮮冰凍血漿亞甲藍(lán)病毒滅活前后凝血因子Ⅷ活性含量變化檢測(cè) 制備300人份新鮮冰凍血漿，并按1.3.2進(jìn)行病毒滅活處理。用磁珠法分別檢測(cè)病毒滅活前后凝血因子Ⅷ活性。

1.3.4 亞甲藍(lán)病毒滅活前后HBV-DNA載量（copies/mL）和HCV-RNA載量（copies/mL）檢測(cè)本站采集的無(wú)償獻(xiàn)血者血液經(jīng)廣州血液中心臨床研究所ABI7500fast熒光PCR儀PCR檢測(cè)證實(shí)HBV為陽(yáng)性5袋，HCV陽(yáng)性5袋，無(wú)菌留樣2mL，剩余的血漿加入亞甲藍(lán)光照35min后過(guò)濾無(wú)菌留樣后按照達(dá)因基因試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 病毒滅活后血漿的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

1.4.1 研究對(duì)象 2014 年1～8月隨機(jī)選擇輸注病毒滅活血漿增城各醫(yī)院患者300 例，進(jìn)行病毒滅活后血漿臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)的回顧性研究。

1.4.2 不良反應(yīng)監(jiān)測(cè) 觀察血漿輸注后是否出現(xiàn)輸血不良反應(yīng)。 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：患者輸注血漿后出現(xiàn)惡心、嘔吐、寒戰(zhàn)、 發(fā)熱為有輸血不良反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

亞甲藍(lán)滅活病毒前后凝血因子Ⅷ含量見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了300人份血漿滅活前后凝血因子Ⅷ含量。結(jié)果表明：凝血因子Ⅷ含量滅活前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。標(biāo)本病毒滅活前后血漿HBV-DNA載量（copies/mL）見(jiàn)表2，HCV-RNA載量（copies/mL）見(jiàn)表3。輸注病毒滅活血漿的200例患者無(wú)惡心、 嘔吐、 寒戰(zhàn)、 發(fā)熱等明顯的輸血不良反應(yīng)。

表1 標(biāo)本病毒滅活前后凝血因子Ⅷ含量變化情況

表1 標(biāo)本病毒滅活前后凝血因子Ⅷ含量變化情況

注：t=8.15，P＜0.01

?

表2 標(biāo)本病毒滅活前后血漿HBV-DNA載量（copies/mL）

表3 標(biāo)本病毒滅活前后血漿HCV-RNA載量（copies/mL）

3 討論

新鮮冰凍血漿輸注目的主要為補(bǔ)充多種獲得性凝血因子缺乏、 補(bǔ)充蛋白質(zhì)、 促進(jìn)傷口愈合、 擴(kuò)容等。其中合理輸注目的為血栓性血小板減少性紫癜、 血漿置換、 補(bǔ)充多種獲得性凝血因子缺乏。本站是廣州市增城地區(qū)的唯一血站，增城地區(qū)臨床對(duì)新鮮冰凍血漿使用十分廣泛，也存在不合理使用新鮮冰凍血漿的現(xiàn)象，從2003年開(kāi)站新鮮冰凍血漿的使用量逐年增長(zhǎng)。新鮮冰凍血漿在臨床上需求量大，受檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)手段的限制，處于“窗口期”的病毒攜帶者可出現(xiàn)漏檢，因此對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活處理，對(duì)于降低由此導(dǎo)致的病毒感染危險(xiǎn)性是非常重要的。而血漿是傳播疾病的重要血液制品之一。我國(guó)南方是乙肝病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，增城位于廣州的東部城市，也是乙肝病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，按照無(wú)償獻(xiàn)血人數(shù)計(jì)算，即使已經(jīng)做了乙肝初篩的情況下，本站開(kāi)站至今已經(jīng)驗(yàn)出乙肝1514例，占無(wú)償獻(xiàn)血總?cè)藬?shù)的1.59%，并且呈逐年增加的趨勢(shì)。對(duì)于乙型和丙型肝炎及艾滋病的傳播主要通過(guò)血液傳播，輸血是其中一個(gè)傳播途徑。本站根據(jù)GB 18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》[3]（2012版）的要求采用了國(guó)家規(guī)定的2個(gè)不同生產(chǎn)廠家的ELISA試劑雙人對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行檢定。但是由于資金等原因，本站未能開(kāi)展核酸檢測(cè)。相較于核酸檢測(cè)，HBsAg的第四代ELISA試劑，“窗口期”仍然延長(zhǎng)了6～15d；而HCV ELISA檢測(cè)“窗口期”延長(zhǎng)41～60d；檢測(cè)HIV抗體及血清p24抗原的進(jìn)口ELISA試劑能在感染后16～22d查出，而進(jìn)行核酸檢測(cè)HIV-RNA可在感染后11d查出[4]。核酸技術(shù)檢測(cè)比ELISA檢測(cè)病毒的“窗口期”要短，在沒(méi)有開(kāi)展核酸檢測(cè)的條件下，同時(shí)要降低感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，那么使用病毒滅活血漿就有極其重要的必要性了，亞甲藍(lán)光化學(xué)療法血漿病毒滅活技術(shù)操作簡(jiǎn)單方便，非常適合在增城地區(qū)進(jìn)行臨床推廣應(yīng)用。

本研究不僅檢測(cè)了亞甲藍(lán)/光照法病毒滅活血漿的質(zhì)量指標(biāo)，還觀察了輸注病毒滅活血漿后不良反應(yīng)的發(fā)生率，未發(fā)現(xiàn)輸注病毒滅活血漿后發(fā)生明顯的不良反應(yīng)同相關(guān)地區(qū)報(bào)道的一致[5-6]。其原因可能在于，亞甲藍(lán)/光照法滅活病毒，不僅破壞了病毒復(fù)制及感染能力，抑制病毒經(jīng)血傳播，同時(shí)還濾除了血漿中殘留的白細(xì)胞（血漿中的殘留白細(xì)胞含量與非溶血性發(fā)熱反應(yīng)等疾病相關(guān)），使輸注血漿后的不良反應(yīng)有所減少[7]。

本研究根據(jù)病毒滅活新鮮冰凍血漿質(zhì)量控制項(xiàng)目的條款對(duì)2014年1～8月的300人份的新鮮病毒血漿滅活前后的血液成分和功能的影響進(jìn)行了比較。表1結(jié)果顯示凝血因子Ⅷ含量滅活前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的血漿凝血因子Ⅷ含量均有不同程度的下降相一致[8-10]；但是滅活后的凝血因子Ⅷ含量依然符合《全血及成分血質(zhì)量要求》里面對(duì)病毒滅活新鮮冰凍血漿質(zhì)量控制的要求。表2、表3結(jié)果顯示病毒滅活后的HBV-DNA及HCV-RNA濃度下降，接近于0[11]。由此可見(jiàn)在增城地區(qū)比較落后的檢驗(yàn)條件下，同時(shí)存在了不合理使用新鮮冰凍血漿的現(xiàn)象的條件下，為了盡可能減少由于輸血感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)展病毒滅活（亞甲藍(lán)光化學(xué)療法）新鮮冰凍血漿能有效地防止經(jīng)輸血傳染疾病的發(fā)生，在臨床應(yīng)用方面是非?？尚械?。

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Clinical application and effectiveness of virus inactivation by methylene blue photochemical method in freshly frozen blood plasma in the regions of Guangzhou Zengcheng

HUANG Siyu ZHONG Liling
Zengcheng Blood Station, Guangzhou Blood Center,Zengcheng 511300, China

Objective In order to investigate the safety and effectiveness of Virus inactivation by methylene blue photochemical method in Guangzhou Zengcheng area, the concentration difference of Factor Ⅷ before and after the virus inactivation process was measured. Methods The concentrations of Factor Ⅷ in three hundred bags of freshly frozen blood plasma without virus inactivation were measured and used as a control group. Then virus inactivation procedures were performed on the three hundred bags of freshly frozen blood plasma mentioned above and the concentration of Factor Ⅷ was measured again. The difference in the concentration of Factor Ⅷ before and after virus deactivation were calculated. Two groups of five bags of freshly frozen blood plasma, which were confirmed to contain Hepatitis B Virus(HBV) and Hepatitis C Virus (HCV) respectively, were analyzed with quantitative fluorescent Polymerase Chain Reaction (PCR) before and after methylene blue photochemical treatment to study the effectiveness in virus inactivation. Random testing was performed among 200 patients who received virus inactivated blood plasma transfusion. These patients were observed for abnormal response after the transfusion. Results The concentration of the factorⅧ before and after virus inactivation were (1.097±0.047)IU/mL and (0.824±0.027)IU/mL respectively. The use of methylene blue photochemical treatment of plasma virus inactivation technology has some influence on the plasma composition, but meets the GB 18469-2012 “Whole Blood and Blood Components Quality Requirements”for virus inactivation of freshly frozen plasma. After virus inactivation， HBV-DNA and HCV-RNA load in sample blood plasma were less than 1000 copies/mL. There is no abnormal response observed in patients who received virus inactivation blood plasma transfusion. Conclusion Experiments showed that the method is clinically safe and effective. Virus inactivation of freshly frozen blood plasma is proven to effectively reduce the potential safety hazard caused by clinical blood transfusion. It is feasible to implement this method in Guang Zhou Zeng Cheng region.

Methylene blue; Inactivation of virus; Frozen blood plasma

R457.1

B

2095-0616（2015）08-196-04

2015-01-08）

廣東省廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目

（20131A041029）。