張夢翔 夏丹 施高翔 陸克喬 邵菁 吳大強 汪天明 汪長中

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥，230038）

白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌VVC臨床株黏附作用的影響

張夢翔1夏丹1施高翔1陸克喬1邵菁1吳大強1汪天明2汪長中1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥，230038）

目的 探討白頭翁湯正丁醇提取物 （Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction，BAEB）對外陰陰道念珠菌?。╒ulvovaginal Candidiasis，VVC）白念珠菌臨床分離株黏附作用的影響。方法 平板法檢測與BAEB共培養(yǎng)2 h、4 h時白念珠菌的CFU；XTT還原法檢測與BAEB共培養(yǎng)2 h、4 h的白念珠菌代謝活性；試管法檢測白念珠菌絮凝能力；水?烴兩相法檢測白念珠菌細胞表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）；熒光顯微鏡觀察菌體活力；掃描電鏡觀察白念珠菌細胞形態(tài)；qRT?PCR法檢測黏附相關(guān)基因ALS1、CSH1、HWP1、ALS5、ALA1、INT1、MNT2與ALS3的表達。結(jié)果 512、1 024 μg／mL BAEB可顯著抑制黏附2 h、4 h時的白念珠菌的CFU及代謝活性；肉眼和倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)512、1 024 μg／mL BAEB可明顯延緩絮凝產(chǎn)生的時間；256、512、1 024 μg／mL的BAEB均能夠顯著減少白念珠菌的細胞表面疏水性；qRT?PCR檢測表明1 024 μg／mL的BAEB作用后，ALS1、CSH1、ALA1、ALS3、INT1、HWP1分別下調(diào)18.7%、36%、37.8%、29.6%、19.9%、21.6%，ALS5與MNT2未產(chǎn)生明顯變化。結(jié)論 BAEB可能通過調(diào)節(jié)黏附相關(guān)基因抑制白念珠菌VVC臨床株的黏附作用。

白頭翁湯正丁醇提取物；外陰陰道念珠菌??；白念珠菌；黏附

［Chin J Mycol，2015，10（1）：25?30］

外陰陰道念珠菌?。╒ulvovaginal Candidiasis，VVC）是一種是由念珠菌引起的婦科常見外陰陰道感染性疾病，表現(xiàn)為尿痛、性交痛、尿頻等，癥狀嚴重時患者坐臥不安，嚴重影響患者的日常生活［1］。引起VVC的主要病原體為白念珠菌，其通過分泌一系列黏附素黏附并定植于宿主上皮細胞，當宿主免疫力下降或局部微環(huán)境平衡被破壞時則造成感染。由于黏附是白念珠菌感染的第一步，因此，抑制白念珠菌黏附對控制其感染至關(guān)重要。

近年來，中醫(yī)藥在治療VVC方面取得了長足進展，從豐富的中藥資源中發(fā)掘出許多具有抗真菌功效的藥物。與傳統(tǒng)抗真菌藥物相比，中藥治療陰道炎具有療效穩(wěn)定、毒性低、不易耐藥等優(yōu)點［2?5］。其中白頭翁湯就是一種近年來被嘗試用于臨床治療VVC的中藥復(fù)方［6］。本課題組前期實驗也發(fā)現(xiàn)該復(fù)方的正丁醇提取物 （BAEB）有抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的作用（待發(fā)表）。鑒于黏附在白念珠菌感染中的重要性，本實驗擬探討B(tài)AEB干預(yù)VVC臨床株黏附的分子機制，旨在為其臨床運用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌VVC臨床分離株（CA01）由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科劉小平主任惠贈。

藥物 白頭翁湯按國家中醫(yī)藥管理局統(tǒng)一組織編審的普通高等類教育中醫(yī)類規(guī)劃教材《方劑學(xué)》中的藥物（白頭翁、黃柏、黃連、秦皮）組成，購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)鑒定。使用80%乙醇70℃回流3 h后過濾，收集濾渣，共重復(fù)回流3次后，濾液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照極性梯度萃取3次，萃取液65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至結(jié)晶干燥，得到白頭翁湯各溶劑提取物。經(jīng)過活性篩選發(fā)現(xiàn)正丁醇提取物體外抗白念珠菌的活性最強，故本實驗以該提取物為供試藥；陽性對照藥氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)LZ）標準品購于中國食品藥品檢定研究院（批號100314?201204）。

試劑 pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德生物科技有限公司），無水乙醇 （上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司），溶壁酶（Sigma公司），F(xiàn)DA（熒光素雙乙酸酯，Sigma公司），25%戊二醛、正辛烷（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），Total RNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑（日本ToyoBo公司），引物（上海生工生物工程有限公司），XTT（加拿大BBI公司），維生素K3（Alexis公司）。

培養(yǎng)基 制備RPMI 1640液體培養(yǎng)基，濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆?。沙氏培養(yǎng)基 （青島高科技海博生物技術(shù)有限公司），YPD培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)責任有限公司）。

實驗儀器 聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板，24孔微量培養(yǎng)板（美國Corning公司），DPH?9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海一恒科技有限公司），血細胞計數(shù)板 （上海求精生化試劑儀器有限公司），CKX41?32型倒置顯微鏡 （日本 Olympus公司），DMI60000B倒置熒光顯微鏡（德國徠卡光學(xué)儀器公司），掃描電鏡（荷蘭FEI公司，型號Sirion200），ABI Spectra Max M2e多功能酶標儀 （美谷分子儀器（上海）有限公司），ABI7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 方法

菌液配制 從4℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37℃、振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細胞計數(shù)板計數(shù)，RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU／mL備用。

平板法檢測白念珠菌與BAEB共培養(yǎng)2 h、4 h的CFU變化 取2 mL菌液（2×106CFU／mL）分別與2 mL終濃度為0、256、512和1 024 μg／mL的BAEB和終濃度為128 μg／mL的FLZ于6孔板中混合，37℃培養(yǎng)2 h、4 h后，吸取100 μL培養(yǎng)基，置于新的無菌試管中，加入2 mL無菌PBS混合，稀釋后均勻涂布于沙氏平板上，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后取出，計數(shù)CFU。

XTT還原法評價與BAEB共培養(yǎng)白念珠菌的代謝活性［7］取濃度為128 μg／mL FLZ和濃度為256、512、1 024 μg／mL的BAEB 100 μL與菌液（2 ×106CFU／mL）100 μL依次加入96孔微量培養(yǎng)板中，并設(shè)空白對照組，培養(yǎng)2 h、4 h后吸棄培養(yǎng)基，無菌 PBS輕輕洗去未黏附菌，各孔加入 50 μL XTT，避光繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，492 nm處測定A值。

絮凝實驗［8］吸取1×107CFU／mL的菌液2 mL加入試管，再分別加入終濃度為256、512、1 024 μg／mL的BAEB 2 mL，37℃緩慢振搖培養(yǎng)4 h后，渦旋振蕩數(shù)秒，靜置2 min后觀察并拍照。

細胞表面疏水性實驗［8］白念珠菌細胞表面疏水性采用水?烴兩相法測定。分別取終濃度256、512、1 024 μg／mL的BAEB與菌液2 mL（濃度為2×106CFU／mL）共孵育24 h后離心，再用無菌PBS重懸，配制成OD600＝1的菌液，每組取1.2 mL懸液于一潔凈玻璃試管內(nèi)，加入0.3 mL正辛烷。旋渦混勻3 min，靜置待兩相分離。兩相分離后立即測定水相的OD600nm值。以不加正辛烷的PBS菌液的OD600值作為陰性對照。CSH計算方法為：相對疏水性＝（OD600對照?OD600實驗）／OD600對照，并拍照。

熒光顯微鏡觀察白念珠菌活性 取1 mL（2× 106CFU／mL）菌液與1 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg／mL BAEB于6孔板中混合，每孔分別置入經(jīng)75%乙醇浸泡24 h的蓋玻片 （1 cm×1 cm），37℃，培養(yǎng)4 h后取出，配制FDA熒光染料至工作濃度（10 mg／L），避光染色30 min，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

掃描電鏡觀察白念珠菌形態(tài) 將1 mL菌液（2×106CFU／mL）加入24孔板各孔中，分別加入1 mL終濃度分別為256 μg／mL、512 μg／mL、1 024 μg／mL的BAEB，菌藥混合后加入經(jīng)過滅菌處理的醫(yī)用導(dǎo)管片，37℃培養(yǎng)4 h后，將待檢測的導(dǎo)管片標本取出，以PBS輕洗2次，于預(yù)冷2.5%（v／v）戊二醛溶液中避光固定2 h，再次用PBS輕洗2次，乙醇梯度脫水（30%，10 min；70%，10 min；95%，10 min；100%，10 min），過夜干燥后鍍金，使用掃描電鏡觀察并拍照。

逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（qRT?PCR）檢測白念珠菌黏附基因的表達 總RNA的提取 2 mL菌液（2× 106CFU／mL）與2 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg／mL BAEB混合，37℃孵育4 h后，離心收集菌體，用無菌PBS沖洗3次后進行總RNA提取，調(diào)節(jié)RNA濃度，使菌體模板量一致。具體操作方法參照ToyoBo公司MagExtractor?RNA?提取試劑說明書進行。

引物的設(shè)計與合成 基因序列從NCBI獲得，并用Oligo 7.0軟件設(shè)計所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情況見表1。

反轉(zhuǎn)錄為cDNA 6 μL RNA預(yù)變性（65℃ 5 min，4℃ 1 min），后加入混合B液2 μL，5RT?Master MixII 2 μL混合后按如下條件進行反轉(zhuǎn)錄：50℃，5 min；98℃，5 min；4℃，1 min。反應(yīng)完成后將cDNA稀釋10倍備用。

實時熒光定量PCR反應(yīng) 采用SYBR熒光探針法，反應(yīng)體系 25 μL：2×SYBR Green Realtime PCR 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol／L）1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。在ABI7500熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 60 s；擴增定量程序（amplification and quantification program）40個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：變性95℃ 15 s；退火50℃ 15 s；延伸72℃ 45 s；熔解曲線（melting curve）：60～95℃，加熱速率為0.1℃／s。內(nèi)參基因為ACT1。每個樣品均設(shè)置3重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

定量分析 實時熒光定量PCR分析分別測定目的基因 ALS1、CSH1、HWP1、ALS5、ALA1、INT1、MNT2與ALS3及內(nèi)參ACT1的Ct值，實驗結(jié)果取其平均值?；虮磉_水平用倍數(shù)變化來表示（2?ΔΔCt法）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 BAEB對白念珠菌培養(yǎng)2 h、4 h的CFU的影響

通過計數(shù)平板CFU，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BAEB作用白念珠菌2 h和4 h后，512和1 024 μg／mL兩個濃度組均能抑制白念珠菌的生長 （結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義），256 μg／mL作用不明顯（見圖1）。

2.2 BAEB對白念珠菌黏附2 h、4 h代謝活性的影響

XTT檢測BAEB對白念珠菌代謝活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當藥物作用2 h后，與空白組（0 μg／mL）相比，512 μg／mL、1 024 μg／mL組的白念珠菌代謝活力顯著下降；藥物作用4 h后，與空白組（0 μg／mL）相比三個濃度組均有明顯的抑制作用，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

2.3 BAEB對白念珠菌絮凝能力的影響

由圖3上排可以看出，對照組出現(xiàn)較多絮狀物，并且沉降到試管底部，256 μg／mL組也出現(xiàn)少量絮狀物，而512、1 024 μg／mL組未出現(xiàn)絮狀物。

由圖3下排即倒置鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞大量黏附堆積，成塊狀，隨著BAEB濃度的不斷增加，塊狀堆積越來越少。

2.4 BAEB對白念珠菌白念珠菌細胞表面疏水性的影響

BAEB作用后，與對照組相比，1 024 μg／mL組烴相（上層）內(nèi)幾乎無渾濁，512 μg／mL、256 μg／mL組烴相（上層）輕度渾濁。由OD值計算顯示與空白對照組相比，均有明顯差異，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖4）。

2.5 熒光顯微鏡觀察白念珠菌活性

空白對照組可見大量綠色熒光細胞，隨著BAEB的濃度增加，綠色熒光菌體逐漸減少（見圖5）。

2.6 掃描電鏡觀察白念珠菌形態(tài)

如圖6所示，培養(yǎng)4 h后，空白組可見大量白念珠菌互相黏附堆積，隨著BAEB濃度不斷增加，黏附在導(dǎo)管表面的菌體越來越少。

2.7 BAEB對白念珠菌黏附基因的影響

與空白組相比，1 024 μg／mL BAEB干預(yù)組INT1、ALS3、ALA1、ALS1、CSH1、HWP1分別下調(diào)為空白對照組的19.9%、29.6%、37.8%、18.7%、36%、21.6%；512 μg／mL BAEB干預(yù)后，上述6個基因中，除INT1外分別下調(diào)為空白對照組的34.1%、47.8%、33.6%、40.5%、29.2%；256 μg／mL組上述各基因表達量變化均無明顯差異；此外各濃度組中MNT2與ALS5基因均未見明顯變化（見圖7）。

圖1 BAEB對黏附2 h、4 h的白念珠菌CFU的影響（?.與對照組相比，P＜0.05） 圖2 BAEB對黏附2 h、4 h的白念珠菌代謝活力的影響（?.與對照組相比，P＜0.05） 圖3 BAEB對白念珠菌絮凝能力的影響（上排為直接觀察，下排為倒置顯微鏡下觀察） 圖4 BAEB對白念珠菌細胞表面疏水性影響 圖5 熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌黏附的影響（×400）：a.對照組，b.256 μg／mL BAEB組，c.512 μg／mL BAEB組，d.1 024 μg／mL BAEB組（?.與對照組相比，P＜0.05） 圖6 電鏡下觀察BAEB對白念珠菌黏附的影響（×3 000）：a.對照組，b.256 μg／mL BAEB組，c.512 μg／mL BAEB組，d.1 024 μg／mL BAEB組 圖7 BAEB對白念珠菌黏附相關(guān)基因表達的影響（?.與對照組相比，P＜0.05）Fig.1 The effect of BAEB on adherent Candida albicans CFU for 2 h，4 h Fig.2 The effect of BAEB on metabolic activity of adherent Candida albicans for 2 h，4 h Fig.3 The effect of BAEB on Flocculation of Candida albicans Fig.4 The effect of BAEB on CSH of Candida albicans Fig.5 Fluorescence microscope images of adherent Candida albicans treated with BAEB（×400）：a.control，b.256 μg／mL BAEB，c.512 μg／mL BAEB，d.1 024 μg／mL BAEB Fig.6 Morphological observation on effects of EAHD Candida albicans adhesion with SEM in 4 h：a.control，b.256 μg／mL BAEB，c.512 μg／mL BAEB，d.1 024 μg／mL BAEB Fig.7 Expression of adhesion genes of Candida albicans treatedwith BAEB by qRT?PCR

3 討 論

在VVC的致病過程中，白念珠菌的黏附是第一步，也是關(guān)鍵的一步［8］。因此，明確藥物對其黏附影響的相關(guān)機制，對預(yù)防及治療VVC具有重要意義。白念珠菌黏附在生物或非生物介質(zhì)表面主要是物理化學(xué)黏附方式，白念珠菌通過分泌如I型整合素 （Type I intergrin）、I型凝集素樣黏附素（Type I Agglutin?like adhesion）及I型菌絲孔蛋白（Type I hyphal wall protein）等一系列與黏附有關(guān)的蛋白，增強其黏附能力。這些蛋白可能成為藥物通過抑制其黏附而發(fā)揮抗真菌作用的靶點［9?14］。

本實驗首先利用平板法檢測2 h和4 h時BAEB對白念珠菌抑制能力。結(jié)果顯示，作用4 h后512與1 024 μg／mL組能夠明顯抑制白念珠菌的生長，說明BAEB對白念珠菌具有一定的抑制作用。通過XTT還原法檢測，培養(yǎng)2 h后，512 μg／mL和1 024 μg／mL的BAEB能顯著抑制念珠菌的代謝活性，培養(yǎng)4 h后，所有濃度均能顯著抑制白念株菌的代謝活性。

細胞表面疏水性 （Cell surface hydrophobicity，CSH）是白念珠菌的一個重要的毒力因子，由白念珠菌表面的甘露聚糖化蛋白介導(dǎo)。CSH賦予白念珠菌與宿主細胞或非生命基質(zhì)之間的黏附能力，以及抵御宿主免疫細胞的攻擊［15］。絮凝 （floccula?tion）系細胞?細胞之間的黏附，白念珠菌通過絮凝介導(dǎo)酵母相細胞之間相互黏附進而發(fā)育形成生物膜（biofilm）［16］。疏水性實驗與絮凝實驗結(jié)果表明，BAEB能夠降低白念珠菌細胞表面疏水性及絮凝能力，減少其細胞之間黏附；掃描電鏡也顯示隨著BAEB濃度增大黏附細胞數(shù)不斷減少，同時熒光顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，相比于對照組的大量綠色熒光細胞，BAEB組細胞較稀疏且熒光強度低。

白念珠菌黏附是由一系列黏附相關(guān)基因表達的產(chǎn)物?黏附附素介導(dǎo)引起的。INT1、ALS3、MNT2、ALA1、ALS1、ALS5、HWP1和CSH1等是目前已知明確的黏附相關(guān)基因［9?14］，該類基因的表達下調(diào)往往會導(dǎo)致白念珠菌對宿主細胞黏附性的下降及致病力的減弱。在1 024、512 μg／mL的BAEB干預(yù)下，除MNT2和ALS5表達無明顯差異外，上述其他基因與空白對照組相比下調(diào)均超過50%，總體效應(yīng)趨于降低白念珠菌的黏附能力，提示BAEB抑制白念珠菌的黏附可能是通過影響?zhàn)じ较嚓P(guān)基因來發(fā)揮作用的。

黏附是白念珠菌致病性的一個重要因素。BAEB作為經(jīng)典中藥復(fù)方白頭翁湯提取物可有效抑制白念珠菌的黏附，從而有效降低白念珠菌的致病性，這也為白頭翁湯臨床治療VVC提供實驗依據(jù)。但其抗菌的確切的有效組分以及詳細的作用機制尚有待于進一步研究。

［1］ 樂杰，謝幸，林仲秋，等.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.第7版.人民衛(wèi)生出版社，2008：239?240.

［2］ 張瑾，高月平.中藥治療陰道炎研究進展［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2009，25（2）：135?136.

［3］ 于曉虹，楊國玲，劉曉明，等.氟康唑、特比萘芬和伊曲康唑?qū)Π咨钪榫捏w外敏感性試驗［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2008，22（11）：668?669.

［4］ 張文平，王小麗，黃真，等.肉桂醛體外誘導(dǎo)白色念珠菌耐藥的實驗［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10（35）：148?149.

［5］ 王剛生，鄧潔華.中藥提取組合物（膠囊）對念珠菌及曲霉的體外抗菌實驗［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（4）：884?886.

［6］ 張曉芬，張超云.白頭翁湯加味綜合治療復(fù)發(fā)性念珠菌性陰道?。跩］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（9）：279?281.

［7］ 趙柳婭，蔣京辰，姜遠英，等.黃芩素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌生物被膜作用研究［J］.中國真菌學(xué)雜志，2014，9（2）：70?74.

［8］ Gelis S，de Groot PW，Castillo L，et al.Pga13 in Candida albi?cans is localized in the cell wall and influences cell surface prop?erties，morphogenesis and virulence［J］.Fungal Genet Biol，2012，49（4）：322?331.

［9］ Sundstrom P.Adhesion in Candida spp［J］.Cell Microbiol Cell Microbiol，2002，4（8）：461?469.

［10］ Gaur NK，Klotz SA.Expression，cloning，and characterization of a Candida albicans gene，ALA1，that confers adherence properties upon Saccharomyces cerevisiae for extracellular matrix proteins［J］.Infect Immun，1997，65（12）：5289?5294.

［11］ Asleson CM，Bensen ES，Gale CA，et al.Candida albicans INT1?induced filamentation in Saccharomyces cerevisiae depends on Sla2p［J］.Mol Cell Biol，2001，21（4）：1272?1284.

［12］ GaurNK，Smith RL，Klotz SA.Candida albicansand Saccharomyces cerevisiae expressing ALA1／ALS5 adhere to ac?cessible threonine，serine，or alanine patches［J］.Cell Commun Adhes，2002，9（1）：45?57.

［13］ Spreghini E，Gismondi A，Piccoli M，et al.Evidence for alphav?beta3 and alphavbeta5 integrin?like vitronectin（VN）receptors in Candida albicans and their involvement in yeast cell adhesion to VN［J］.J Infect Dis，1999，180（1）：156?166.

［14］ Fu Y，Ibrahim AS，Sheppard DC，et al.Candida albicans Als1p：an adhesin that is a downstream effector of the EFG1 filamenta?tion pathway［J］.Mol Microbiol，2002，44（1）：61?72.

［15］ De Souza RD，Mores AU，Cavalca L，et al.Cell surface hydropho?bicity of Candida albicans isolated from elder patients undergo?ing denture?related candidosis［J］.Gerodontology，2009，26（2）：157?161.

［16］ Kevin J，Verstrepen，F(xiàn)rans M Kils.Flocculation，adhesion and biofilm formation in yeasts［J］.Mol Microbiology，2006，60（1）：5?15.

Anti?adhesion effect of Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction on Candida albicans isolated from VVC

ZHANG Meng?xiang1，XIA Dan1，SHI Gao?xiang1，LU Ke?qiao1，SHAO Jing1，WANG Tian?ming2，WANG Chang?zhong1
（1.School of Integrated Traditional and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China；2.Institute of Integrated Traditional and Western Medicine，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

Objective To investigate anti?adhesion effect of Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction（BAEB）on Candida albicans.Methods Agar plate assay was used to determine CFU of Candida albicans for 2h and 4h.XTT reduction assay was applied to evaluate the adherent Candida albicans merabolic activity.Test tube assay was utilized to evaluate flocculation.The water?hydrocar?bon two?phase assay was employed to measure the cell surface hydrophobicity of Candida albicans.Scanning electron microscope（SEM）and fluorescein diacetate（FDA）staining was used to observe the morphological changes of adherent Candida albicans.qRT?PCR was adopted to inspect the expression of adhesion?related genes such as INT1，ALS3，MNT2，ALA1，ALS1，ALS5，HWP1 and CSH1.Results 512，1 024 μg／mL BAEB could effectively inhibit adherence of Candida albicans.Flocculation was delayed by 512，1 024 μg／mL BAEB.The cell surface hydrophobicity in the BAEB treated groups was lower than that of the control group.The expres?sion of ALS1，CSH1，ALA1，ALS3，INT1，HWP1 were downregulated dramatically after BAEB treatment，but ALS5 and MNT2 were un?changed.Conclusion BAEB could effectively inhibit adherence of Candida albicans isolated from VVC by regulating adhesion?asso?ciated genes.

butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction（BAEB）；vulvovaginal candidiasis（VVC）；Candida albicans；adhe?sion

R 379.4

A

1673?3827（2015）10?0025?06

2014?11?21

［本文編輯］ 施 慧

安徽省自然科學(xué)基金（1408085MH165），安徽中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項目（2014zr026）

張夢翔，男（漢族），碩士研究生在讀.E?mail：tojosaki＠126.com

汪長中，E?mail：ahwcz63＠sina.com