張迎娜，高 峰，方 華，趙 雪，張 婧，杜 英，潘衛(wèi)東#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州450001 2)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫學(xué)研究室 鄭州450052 3)鄭州市神經(jīng)免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450052

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種免疫介導(dǎo)的特發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，主要損傷視神經(jīng)和脊髓［1］。2004年Lennon 等［2］使用間接免疫熒光方法(IIF)在NMO 患者的血清中發(fā)現(xiàn)了一種能與小鼠小腦、中腦組織選擇性結(jié)合的自身抗體，稱為NMO-IgG。2005年Lennon 等［3］用免疫雙標(biāo)法進(jìn)一步證實(shí)與NMO-IgG 特異性結(jié)合的靶抗原為水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)，并將其抗體稱為抗AQP4 抗體。2006年修訂的Wingerchuk 標(biāo)準(zhǔn)［4］將AQP4 抗體陽性作為NMO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。AQP4 是六次跨膜蛋白，C 端和N 端均在胞內(nèi)，含有3個(gè)胞外環(huán)(A、C、E 環(huán))和兩個(gè)胞內(nèi)環(huán)(B、D 環(huán))，胞外環(huán)為AQP4 抗體結(jié)合的特異性位點(diǎn)［5-7］，因此表達(dá)AQP4 的胞外區(qū)蛋白有望為NMO 的體外診斷提供原料。該研究利用基因工程手段構(gòu)建了表達(dá)pET32a(+)-AQP4 胞外區(qū)的融合蛋白，并進(jìn)行了純化，以期為進(jìn)一步研究AQP4 胞外區(qū)在診斷NMO 方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌株及質(zhì)粒 質(zhì)粒pUC18 購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒pET32a(+)購自Novagen 公司，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)均由鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室饋贈。

1．2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA 連接酶、DNA marker、凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，蛋白Marker、咪唑和氨芐青霉素鈉均購自Genview 公司，IPTG 購自Solarbio 公司，鼠抗組氨酸單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ECL 發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)公司，Ni-NTA 親和層析柱由作者自行裝柱。

1．3 基因的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的AQP4 基因序列(NP_001641．1)，利 用TMHMM Server V2．0 生物軟件在線分析AQP4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過Blast 比對出AQP4 胞外區(qū)的基因序列，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要及大腸埃希菌“密碼子偏嗜性”設(shè)計(jì)并合成6 條寡核苷酸單鏈，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1(僅列3 條)。

1．4 目的基因的克隆及鑒定 將合成的互補(bǔ)寡核苷酸單鏈先用滅菌雙蒸水溶解，在PCR 儀上95℃變性5 min 后自然冷卻至室溫，形成雙鏈DNA。用BamHⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切雙鏈DNA 和pUC18 質(zhì)粒，回收AQP4 胞外區(qū)基因片段和pUC18 質(zhì)粒片段，按目的基因與載體按物質(zhì)的量比為3∶1 的比例，用T4 DNA 連接酶16℃連接18 h。連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，同時(shí)以空質(zhì)粒和滅菌雙蒸水進(jìn)行轉(zhuǎn)化作為對照，涂布于含有IPTG、X-gal、50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h，挑取白色陽性單個(gè)菌落，于37℃200 r/min 搖床上搖菌過夜，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，并進(jìn)行序列比對分析。

表1 寡核苷酸單鏈序列*

1．5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切重組克隆質(zhì)粒pUC18-AQP4 胞外區(qū)和表達(dá)載體pET32a(+)，切膠回收目的基因片段和載體片段，目的基因與載體按物質(zhì)的量比為3∶1 的比例在T4 DNA 連接酶的作用下于16℃連接18 h。連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～18 h。挑取單個(gè)陽性菌落進(jìn)行鑒定，方法同1．4。

1．6 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，涂布于含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～18 h。挑取單個(gè)菌落接種于25 mL 含有50 mg/L 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取菌懸液1 mL 加入到100 mL 新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm為0．4～0．6 時(shí)，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，30℃誘導(dǎo)8 h，收集菌液，12 000 r/min 4℃離心20 min，收集菌體，用PBS 緩沖液重懸，冰浴超聲破碎(超聲10 s，間歇5 s)，12 000 r/min 4℃離心20 min，收集上清液后進(jìn)行150 g/L SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1．7 重組蛋白的純化 收集上述超聲破菌后的上清液，以NTA 層析介質(zhì)進(jìn)行純化，層析柱用Bio-Rad的1 mL 重力空柱，用Ni-NTA 填料自行裝柱。第一步為柱平衡，用0．01 mol/L、pH 8．0 的PBS 緩沖液進(jìn)行柱平衡;第二步為上樣，將離心所得上清液進(jìn)行上樣，使其液體與柱子進(jìn)行吸附15 min;第三步為柱平衡，用含20 mmol/L 咪唑的0．01 mol/L、pH 8．0的PBS 緩沖液進(jìn)行柱平衡，除去未結(jié)合的雜蛋白或結(jié)合不牢的蛋白;第四步為洗脫，通過100、300 mmol/L 咪唑進(jìn)行梯度洗脫，并分管收集樣品。

1．8 重組蛋白的Western blot 鑒定 表達(dá)的重組蛋白經(jīng)150 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離后，利用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，30 g/L 的BSA 封閉液封閉2 h，加入一抗(鼠抗組氨酸單克隆抗體，按1∶2 000 稀釋)，4℃冰箱孵育過夜，次日搖床上用TBST 緩沖液洗滌3次，10 min/次;再加入酶標(biāo)二抗(HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，按1∶10 000 稀釋)，搖床上室溫孵育2 h，用TBST 洗滌3次，10 min/次，暗室中ECL 曝光1 min 后進(jìn)行顯影和定影。

2 結(jié)果

2．1 AQP4 3個(gè)胞外區(qū)形成雙鏈DNA 后的鑒定AQP4 胞外區(qū)寡核苷酸單鏈經(jīng)變性退火后行20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約100 bp 的特異性條帶，見圖1。

圖1 AQP4 胞外區(qū)雙鏈DNA 電泳圖

2．2 AQP4 3個(gè)胞外區(qū)克隆質(zhì)粒的鑒定 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可見約100 bp 的目的條帶，與預(yù)期大小一致，見圖2。測序結(jié)果與AQP4 胞外區(qū)基因完全一致。

2．3 AQP4 3個(gè)胞外區(qū)表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可見約100 bp 的目的條帶，與預(yù)期大小一致，見圖3。測序結(jié)果與AQP4 胞外區(qū)基因完全相符。

2．4 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 表達(dá)的重組蛋白經(jīng)150 g/L的SDS-PAGE 電泳分離后，在相對分子質(zhì)量約為26 000處可見特異性蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，見圖4。

圖2 質(zhì)粒pUC18-AQP4 胞外區(qū)的雙酶切鑒定

圖3 質(zhì)粒pET32a(+)-AQP4 胞外區(qū)的雙酶切鑒定

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE 分析

2．5 純化產(chǎn)物的鑒定

圖5 純化的AQP4 SDS-PAGE 分析

2．5．1 SDS-PAGE 分析 純化的蛋白經(jīng)150 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離后，在相對分子質(zhì)量約26 000處可見特異性蛋白條帶，純度約為75%，見圖5。

2．5．2 Western blot 分析 見圖6。檢測結(jié)果顯示，表達(dá)純化的融合蛋白pET32a(+)-AQP4 胞外區(qū)均可與鼠抗組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合，在相對分子質(zhì)量約為26 000 處可見明顯特異性條帶。然而用AQP4 抗體陽性的血清作為一抗進(jìn)行Western blot，發(fā)現(xiàn)胞外區(qū)蛋白未被血清中的AQP4 抗體特異性識別。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析

3 討論

AQP4 是水通道蛋白家族的成員，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的水通道蛋白，在哺乳動物腦內(nèi)有大量的表達(dá)，主要表達(dá)于室管膜細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的軸突、足突上，參與腦內(nèi)水平衡調(diào)節(jié)，因此，AQP4 與腦水腫的相關(guān)報(bào)道也是層出不窮［8-10］。然而自AQP4 被確定為區(qū)別多發(fā)性硬化與NMO 的特異性抗體的靶抗原以來，對AQP4 在作為體外檢測NMOIgG 抗體原料應(yīng)用方面的研究也陸續(xù)地被報(bào)道:如以組織為底物的IIF［2］，以細(xì)胞為底物的IIF［11-12］、放射免疫沉淀法［13］、熒光免疫沉淀法［14］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)［15］、流式細(xì)胞術(shù)［16］及Western blot［17］，但靈敏度或特異度低、操作繁瑣、費(fèi)用昂貴等原因限制了其在國內(nèi)大規(guī)模的推廣和應(yīng)用，因此建立一種適合國人NMO 的檢測方法非常必要。

原核表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚、培養(yǎng)方法比較簡單、經(jīng)濟(jì)、蛋白表達(dá)量高、易于大規(guī)模工藝化生產(chǎn)，且技術(shù)已相當(dāng)成熟，因此成為目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)之一。但由于缺乏合適的翻譯后加工機(jī)制，表達(dá)的產(chǎn)物不能進(jìn)行翻譯后修飾，從而不能有效地折疊形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，且利用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白時(shí)很難獲得大量的可溶性蛋白，而蛋白的可溶性是保證蛋白生物活性的先決條件。Trx A 是大腸桿菌的自身蛋白，具有熱穩(wěn)定性及氧化還原作用，作為融合標(biāo)簽可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，并能輔助蛋白二硫鍵的形成及正確折疊。通常情況下在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的蛋白通過與Trx A標(biāo)簽融合表達(dá)，均可以獲得可溶性的表達(dá)蛋白［18-19］。該研究通過Trx A 與AQP4 胞外區(qū)的融合表達(dá)成功獲得了可溶性表達(dá)的AQP4 胞外區(qū)，且在pET32a(+)載體中存在6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，利用Ni2+親和層析柱具有吸附6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的高度特異性，通過一步親和層析也可達(dá)到較高的純度。

該研究表達(dá)的AQP4 3個(gè)胞外融合蛋白通過ExPASy 軟件在線預(yù)測其相對分子質(zhì)量約為23 000，然而在經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后發(fā)現(xiàn)融合蛋白的相對分子質(zhì)量均在26 000 左右，這可能是組氨酸標(biāo)簽的原因［20］:因?yàn)榻M氨酸是堿性氨基酸，且是帶正電荷的，而載體中的組氨酸標(biāo)簽中含有6個(gè)連續(xù)組氨酸，帶有大量的正電荷，降低了蛋白在SDS-PAGE 中遷移的速度，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)表觀相對分子質(zhì)量與實(shí)際相對分子質(zhì)量存在一定的偏差。

利用表達(dá)的AQP4 胞外區(qū)蛋白與篩選的AQP4抗體陽性血清進(jìn)行Western blot，發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白未被抗體特異性識別，作者推測其中的原因可能是僅表達(dá)胞外區(qū)不能形成三維空間結(jié)構(gòu)，而抗體識別的是蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，但這一推測有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，該研究完成了AQP4 胞外區(qū)與Trx A 的可溶性融合表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)行AQP4 胞外區(qū)的生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

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