王科妍，崔蕊蕊，丁 中，崔留欣，趙明旭，程學(xué)敏，巴月#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州450001 2)山東萬杰醫(yī)學(xué)院山東省高校生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)實驗室 淄博255213 3)開封市疾病預(yù)防控制中心地方病科 開封475000

氟斑牙作為地方性氟中毒的特征性表現(xiàn)之一，對兒童危害深遠(yuǎn)。以往研究［1-3］顯示氟斑牙的發(fā)生除了與個體氟暴露的劑量、年齡、時間、營養(yǎng)因素等有關(guān)外，還存在個體易感性。雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)基因多態(tài)性與兒童氟斑牙有關(guān);DNA 甲基化作為表觀遺傳特性之一目前受到廣泛關(guān)注，研究［4-6］發(fā)現(xiàn)ERα 基因甲基化與乳癌、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān)。但氟暴露是否引起ERα 基因甲基化改變，以及ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平與兒童氟斑牙患病程度是否有關(guān)，目前尚未見報道。該研究通過測定氟病區(qū)兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平，分析兒童氟斑牙及血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關(guān)系，旨在從表觀遺傳學(xué)角度探討兒童氟斑牙的發(fā)病機(jī)制。

1 對象與方法

1．1 調(diào)查點的選擇 在精確檢測水氟含量的基礎(chǔ)上，從河南省某縣飲水型地方性氟中毒流行地區(qū)選擇飲水氟質(zhì)量濃度超過1．0 mg/L 的2 所小學(xué)作為調(diào)查點。2 所學(xué)校所在地區(qū)經(jīng)濟(jì)水平、人口分布、自然條件、農(nóng)作物種類、飲食習(xí)慣、人口構(gòu)成基本相同。同時測定環(huán)境介質(zhì)(水、空氣、土壤、農(nóng)作物等)中鈣水平，排除其他元素干擾。

1．2 調(diào)查對象的選擇 整群抽取所選調(diào)查點8～12歲且自出生一直居住在當(dāng)?shù)氐膬和?排除臨床上患有影響鈣磷代謝疾病和近期接受鈣劑、氟化物、激素治療的兒童)作為調(diào)查對象，共有174 名兒童入選。對符合調(diào)查要求的兒童分別進(jìn)行問卷調(diào)查、氟斑牙檢查、體格檢查，并采集生物樣本。研究經(jīng)家長簽署知情同意書，遵循兒童意愿，并經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1．3 生物樣本的采集及處理 采集所有調(diào)查兒童空腹外周靜脈血10 mL(非抗凝和EDTA 抗凝各5 mL)及晨尿100 mL。非抗凝血離心分離血清，并與抗凝血和尿液一起置于－80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 兒童氟斑牙的判定 兒童氟斑牙檢查及結(jié)果判定由地方性氟中毒防治公共衛(wèi)生執(zhí)業(yè)醫(yī)師按照Dean 分級法［7］進(jìn)行。將分級為0(正常)和1(可疑)的調(diào)查對象定義為正常組，2(極輕)和3(輕度)定義為輕度組，4(中度)和5(重度)定義為中重度組。174例兒童中，正常組85 人，輕度組53 人，中重度組36 人。

1．5 生物樣本檢測分析

1．5．1 兒童尿氟水平的測定 采用氟離子選擇電極(PF-1 型，上海電元器件廠)法測定調(diào)查對象尿氟水平。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0．1～10．0 mg/L，r均＞0．999［8］。以尿氟質(zhì)量濃度超過1．5 mg/L 判斷為高氟負(fù)荷狀態(tài)。

1．5．2 兒童血清鈣水平的測定 將強(qiáng)酸(濃鹽酸與高氯酸體積比為1∶4 的混合酸)與血清按體積比1∶100 混合、消化后，采用原子吸收分光光度計(Z-5000 型，日立，日本)以標(biāo)準(zhǔn)曲線法(r ＞0．999)進(jìn)行檢測，所有樣品均測定2個平行樣。

1．5．3 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率檢測 應(yīng)用UCSC/Ensembl(http://genome．ucsc．edu/)查 找 基因啟動子序列，采用甲基化引物設(shè)計軟件Methyl Primer Express v1．0 設(shè)計引物序列(表1)。基因組DNA 提取采用血液基因組柱式小量提取試劑盒(北京康為世紀(jì));采用EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒(Zymo Research，美國)對提取的基因組DNA 進(jìn)行處理。

表1 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化引物序列及產(chǎn)物大小

ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率檢測采用real-time PCR 方法。20 μL 反應(yīng)體系中包括2 ×Ultra SYBR Green PCR Mix(北京康為世紀(jì))10 μL，上、下游引物各160 nmol/L，300 ng DNA，6．5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件:95℃10 min;94℃15 s，54℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。以純水作為陰性對照對實驗進(jìn)行質(zhì)量控制。參考文獻(xiàn)［9］方法計算DNA 甲基化率。1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)的錄入采用EpiData 2．0，雙人雙機(jī)獨立錄入，分析采用SPSS 12．0。ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，將其對數(shù)轉(zhuǎn)化后符合正態(tài)分布。3組間患兒年齡、尿氟、血清鈣水平及對數(shù)轉(zhuǎn)化后的ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的比較采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗，性別構(gòu)成的比較采用χ2檢驗。以ERα 基因甲基化率為因變量，尿氟、血清鈣水平、年齡、性別(賦值:男性=1，女性=2)為自變量做多重線性回歸進(jìn)行影響因素篩選，對主要影響因素血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率進(jìn)行相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同組別兒童基本變量的分析 結(jié)果見表2。調(diào)查地區(qū)兒童氟斑牙患病率為51．15%。由表2 可知，不同氟斑牙分度的兒童年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，性別構(gòu)成差異有統(tǒng)計學(xué)意義。中重度組兒童尿氟水平高于正常組和輕度組。輕度組兒童血清鈣水平低于正常組。

表2 3組兒童基本變量的比較

2．2 不同組別兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率比較 結(jié)果見表3。由表3 可知，不同組別兒童甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3組男性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且中重度組兒童高于正常組兒童。3組女性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 3組ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率比較 %

2．3 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣水平的相關(guān)分析 結(jié)果顯示:血清鈣為ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的影響因素(t =2．281，P =0．024)。對ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣水平進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果為:r= －0．172，P=0．024。

3 討論

3．1 血清鈣水平與兒童氟斑牙 該研究發(fā)現(xiàn)氟病區(qū)輕度氟斑牙患兒血清鈣水平較非患兒降低，但中重度組與正常組兒童比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與史曉紅等［10］的研究結(jié)果一致。高氟與腸道和血液中的鈣離子結(jié)合形成氟化物，影響鈣的吸收和沉積，進(jìn)而引起血鈣暫時性降低可能是其主要原因。高氟和低鈣共同作用使甲狀旁腺激素分泌增多，促進(jìn)破骨細(xì)胞骨轉(zhuǎn)換作用加快，是血鈣在氟斑牙患病后期又趨于正常的原因。有研究［11］發(fā)現(xiàn):用氟化鈉喂飼的小鼠60 d 內(nèi)血清鈣離子水平較正常飼養(yǎng)的小鼠低，而60 d 后血清鈣水平又上升。李廣生等［12］提出的地方性氟中毒屬于“鈣矛盾疾病”的觀點指出:細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增多可能是低鈣加重氟中毒的重要機(jī)制，低水平氟對鈣泵的作用是正性作用，而隨著氟水平的升高，鈣泵的活性明顯下降，反映出一種非線性的或前后矛盾的“全劑量-效應(yīng)”鈣曲線趨勢，又稱U型劑量反應(yīng)，也是鈣水平恢復(fù)的原因之一。

3．2 血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關(guān)系 該研究發(fā)現(xiàn)，血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率呈負(fù)相關(guān)，即隨著ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的升高，血清鈣水平有下降趨勢。關(guān)于血清鈣與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平的關(guān)系，以往研究比較少。有研究［5］發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平在絕經(jīng)后婦女顯著高于絕經(jīng)前的婦女。產(chǎn)生這種關(guān)系的可能原因是，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化使ERα 基因表達(dá)降低或者沉默，引起雌激素抵抗［13］，使雌激素對腸道鈣離子的吸收及腎小管對鈣離子重吸收的促進(jìn)作用減弱，且對鈣離子的排泄作用增強(qiáng)［14-15］，從而引起血清鈣水平下降。

3．3 兒童氟斑牙與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關(guān)系 該研究發(fā)現(xiàn)，隨著氟斑牙患病程度的加重，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且這種變化具有性別差異，表現(xiàn)為中重度組男性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率高于正常組和輕度組兒童。目前尚缺乏ERα 基因甲基化與氟斑牙關(guān)系的研究，但有研究［16］表明雌激素對骨骼發(fā)育的影響十分明顯，特別是對刺激成骨細(xì)胞活動、促進(jìn)鈣磷的骨內(nèi)沉積具有重要作用。牙齒的形成與骨骼有相似之處，氟斑牙的某些病理改變也與氟骨癥相似。以往研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平與其轉(zhuǎn)錄活性呈負(fù)相關(guān)，甲基化水平升高導(dǎo)致ERα 表達(dá)下調(diào)或沉默，進(jìn)而影響雌激素的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣離子水平呈負(fù)相關(guān)，提示ERα 基因甲基化可能影響機(jī)體鈣代謝，從而參與氟斑牙的形成。由于該研究為氟斑牙與表觀遺傳改變的探索性研究，涉及樣本含量較小，因此，需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，增加樣本含量以驗證研究結(jié)果，為氟中毒發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制研究提供新的思路。

致謝:感謝參與課題現(xiàn)場調(diào)查工作的鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、開封市疾病預(yù)防控制中心及通許縣疾病預(yù)防控制中心地方病科的工作人員;感謝所有參與此項研究的調(diào)查對象。

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