張曉敏，楊輝，施鳴，胡大鳴，劉愛英，鄒曉,3

1貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 貴陽 550002；2貴州大學(xué)真菌資源研究所 貴陽 550025；3貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

植物保護(hù)

防治煙草甲白僵菌的倉儲(chǔ)應(yīng)用菌株選育

張曉敏1，楊輝1，施鳴1，胡大鳴1，劉愛英2，鄒曉2,3

1貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 貴陽 550002；2貴州大學(xué)真菌資源研究所 貴陽 550025；3貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

為將白僵菌應(yīng)用于煙葉儲(chǔ)存醇化的倉儲(chǔ)環(huán)境，對其進(jìn)行抗干旱、耐高溫菌株選育。通過溫度篩選獲得能夠在35℃下生長的球孢白僵菌GZUIFR-GL5菌株。該菌株通過紫外線和微波在150s下的組合誘變和PEG脅迫篩選，得到具有生長穩(wěn)定且能夠耐受-0.8Mpa的較低水勢和35℃環(huán)境條件的突變菌株GZUIFR-GL5-08i。測定GZUIFR-GL5-08i部分生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)蛋白含量、脯氨酸、SOD、CAT、POD等含量均比誘變前菌株提高，反映了在抗旱機(jī)理方面蟲生真菌與植物抗逆機(jī)理有相似性。

倉儲(chǔ)害蟲；煙草甲；白僵菌；抗旱機(jī)理

煙葉在儲(chǔ)藏期間會(huì)面臨多種蟲害的危害[1]，對煙葉危害性最嚴(yán)重的兩種害蟲為煙草甲（Lasioderma serricorne Fabricius）和煙草粉螟（Ephestia elutella Hubner）[2]。由于煙葉調(diào)撥流通頻繁，檢疫控制措施不是十分有效，儲(chǔ)煙害蟲的分布區(qū)域正逐年擴(kuò)大，嚴(yán)重影響了卷煙品質(zhì)[3]。此外，煙葉等級(jí)越高，蟲害越嚴(yán)重；煙葉儲(chǔ)存期越長，蟲損越嚴(yán)重[4]。據(jù)報(bào)道我國儲(chǔ)存煙葉的直接蟲損率為1.64%[5]。目前控制煙草甲最為常規(guī)的做法是化學(xué)熏蒸，效果雖然顯著但對操作人員和環(huán)境的危害也十分突出，因此開發(fā)新的安全防治技術(shù)迫在眉睫。2007年我國全面禁止了甲胺磷等5種高毒農(nóng)藥的生產(chǎn)、銷售，這反映了國家未來的政策導(dǎo)向[6]。這些變化說明國家政策和煙草產(chǎn)業(yè)形勢迫使煙草行業(yè)向安全、有機(jī)、生態(tài)方向發(fā)展。

在倉儲(chǔ)害蟲煙草甲的防治技術(shù)中生物防治領(lǐng)域雖一直受到關(guān)注，但是在微生物防治領(lǐng)域的研究文獻(xiàn)一直較少，除一些采用蘇云金芽孢桿菌（BT）的應(yīng)用研究外[7-8]，其它微生物防治技術(shù)鮮有報(bào)道，特別是昆蟲在自然界最主要的微生物天敵-蟲生真菌。蟲生真菌不僅對人畜及作物無害，其寄主不易產(chǎn)生抗性，具有顯著的形成流行病能力和生產(chǎn)便利等優(yōu)點(diǎn)[9]，且蟲生真菌制劑安全，與環(huán)境相容性好[10]。國內(nèi)率先篩選了煙草甲成蟲的致病真菌[11]，也有學(xué)者測試了白僵菌對煙草甲幼蟲的毒力效果[12]。以上研究結(jié)果若要應(yīng)用于煙倉均不太可能實(shí)現(xiàn)。主要問題是倉儲(chǔ)環(huán)境（濕度RH＜75%；溫度T＞32℃）濕度過低溫度過高，有研究者將煙草甲的性引誘劑和白僵菌菌粉一起使用并在進(jìn)行保濕，該方法對煙草甲取得較好的防治效果。但要實(shí)際在倉庫中使用，選育出耐高溫、耐低濕的菌株仍然是重要的途徑[13],具有重要意義。

表1 供試菌株信息Tab. 1 Information of experimental strains

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株在貴州大學(xué)真菌資源研究所（GZUIFR）和貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心均有保藏備份。見表1。

1.2 培養(yǎng)基

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖20g，麥芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂20g，水1000mL。

查 氏 培 養(yǎng) 基：NaNO32g，K2HPO4·3H2O 1g，KCL 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然。

1.3 溫度篩選

將活化好的供試菌株，接種到沙氏和查氏的平板（Φ90mm）中，在生態(tài)培養(yǎng)箱（寧波東南儀器）25±1℃、30±1℃、35±1℃下培養(yǎng)14d，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。測量菌落直徑，取平均值后用小數(shù)點(diǎn)前數(shù)值作為參照指標(biāo)。

1.4 誘變方法

1）紫外誘變：取直徑90mm無菌平皿，加入濃度為1.0×107個(gè)/mL孢子懸液1mL和攪拌棒，在15W紫外燈的30cm處分別攪拌照射30s，60s，90s，120s，150s，180s。蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。將不同照射時(shí)間的菌液0.1mL涂布平板，用黑色袋子包裹培養(yǎng)7天[14]。2）微波誘變：采用頻率為2450MHz功率800W的微波爐進(jìn)行微波輻照誘變，將紫外線150s誘變處理后成活菌落培養(yǎng)的菌株，用含0.5%Tween-80的無菌水洗下菌體，在無菌培養(yǎng)皿中加入1mL菌懸液，進(jìn)行微波處理。每次輻照30s后使平皿冷卻，再進(jìn)行照射，并將照射時(shí)間累計(jì)[15]。以輻射時(shí)間為微波處理劑量指標(biāo)，相同條件非輻射菌懸液的培養(yǎng)平板作為對照，計(jì)算致死率。以致死率超過90%的紫外線誘變劑量150s處理菌懸液，再經(jīng)微波輻射150s后涂布在沙氏培養(yǎng)基上，置于30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，挑取長得好的菌落于25%PEG6000的沙氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以菌落直徑作為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 生長穩(wěn)定突變株的驗(yàn)證

將復(fù)篩獲得的正突變菌株在沙氏培養(yǎng)基上25±1℃連續(xù)傳代8次，每次傳代后接入含25%PEG6000的沙氏培養(yǎng)基100 mL，30±1 ℃培養(yǎng)10d洗濾去除培養(yǎng)基后測定菌絲體干重。

1.6 耐高溫干旱突變菌株的生理指標(biāo)檢測

蛋白含量測定用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定；茚三酮顯色法測定脯氨酸含量；SOD酶活力采用氮藍(lán)四唑法測定；POD酶測定采用愈創(chuàng)木酚法；CAT酶的測定光密度法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度篩選試驗(yàn)

經(jīng)過溫度篩選得到來自廣西的白僵菌菌株能夠耐受較高的環(huán)境溫度，蟲生真菌最適生長溫度一般為30℃以下。國內(nèi)也有研究者篩選到能夠在35℃下正常生長產(chǎn)孢的罕見耐熱的白僵菌菌株[17]。說明蟲生真菌在自然界還是存在合適的耐熱菌株需要去篩選。

表2 菌株在2種培養(yǎng)基上3個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)14d時(shí)的生長速度Tab. 2 Growth velocity of strains cultured on two different media at three different temperatures after 14d

2.2 紫外和微波誘變GZUIFR -GL5孢子的致死率

根據(jù)2.1結(jié)果選擇GZUIFR-GL5球孢白僵菌為初始菌株進(jìn)行誘變，紫外線和微波在150s輻照處理，致死率分別達(dá)到91.8%和92.4%，在180s時(shí)兩種處理方式的死亡率都接近100%，說明GL5球孢白僵菌對紫外光和微波敏感，致死效應(yīng)明顯。根據(jù)誘變機(jī)理，當(dāng)致死率＞90%時(shí)較易引起有效突變，選用150s作為紫外照射和微波輻射的誘變劑量。經(jīng)紫外和微波復(fù)合誘變篩選得1株白僵菌，可以在25% PEG6000的沙氏培養(yǎng)基生長良好，相當(dāng)于水勢為-0.8 Mpa[18]，菌株編號(hào)為GZUIFR-GL5-08i。

2.3 遺傳穩(wěn)定性檢測

為了檢驗(yàn)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，觀察其傳代后脅迫培養(yǎng)的菌絲體生物量。從表3中可以看出菌絲體生物量基本保持穩(wěn)定，說明誘變結(jié)果較好。

表3 紫外與微波誘變處理的致死率Tab. 3 Lethal rate of UV and microwave radiation mutagenesis

表4 GZUIFR-GL5-08i遺傳穩(wěn)定性檢測Tab. 4 Determination of genetic stability for GZUIFR-GL5-08i

2.4 相關(guān)抗性理化指標(biāo)分析

2.4.1 PEG干旱脅迫對白僵菌GZUIFR-GL5-08i游離總蛋白的影響

從圖1中可以看出紫外和微波的復(fù)合誘變對菌株造成了一定的影響，蛋白質(zhì)含量增加了。以0% PEG做對照，誘變株比原始株高出5.90%。對于誘變株而言，蛋白質(zhì)的含量在10% PEG以后就趨于穩(wěn)定，原始菌株也具有類似趨勢。可能是由于環(huán)境的壓力，形成一些在正常狀況下沒有的應(yīng)激蛋白[19]，因此，白僵菌可能為了適應(yīng)脅迫環(huán)境下多合成一些應(yīng)激蛋白。PEG濃度與誘變菌株的蛋白質(zhì)含量存在顯著線性回歸關(guān)系，其回歸方程：y=573.4114x+3588.787（x為PEG含量，用小數(shù)表示；Y為蛋白質(zhì)含量，單位為μg·mL-1，R=0.827425）。

圖1 PEG干旱脅迫對白僵菌GZUIFRGL5-08i游離總蛋白的影響Fig. 1 Effects of different PEG drought stress on free total protein content of GZUIFRGL5-08i

2.4.2 PEG干旱脅迫對白僵菌GZUIFR-GL5-08i脯氨酸和SOD酶的影響

脯氨酸的含量在兩株菌中均是先增后降見圖2。誘變菌株在20% PEG時(shí)達(dá)到最高，為281.22 μg·mL-1，比誘變株的0% PEG同比高出了70.19%。不良環(huán)境中積累的脯氨酸除了作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在細(xì)胞膜修復(fù)、穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、脅迫后的修復(fù)和生長中作為碳源和氮源以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用[20,21]。誘變菌株的脯氨酸含量在20% PEG范圍內(nèi)關(guān)系顯著。其回歸方程為：y=538.7324x+183.5291（R=0.946663，F(xiàn)=25.89356），x為PEG含量，用小數(shù)表示；Y為脯氨酸含量，單位為μg·mL-1。

誘變菌株的SOD酶活力與PEG含量在25%的范圍內(nèi)呈正相關(guān)見圖3。超氧化物歧化酶（SOD）在活性氧代謝中處于重要地位，可淬滅O2-啟動(dòng)的一系列自由基連鎖反應(yīng)造成的生物毒性損傷，為生物體內(nèi)最重要的清除活性氧自由基的抗逆酶類[16]。國內(nèi)研究者也發(fā)現(xiàn)其它蟲生真菌在干旱脅迫時(shí)SOD酶表達(dá)也有很大提高[22]。該突變菌株的SOD酶活在25% PEG范圍內(nèi)關(guān)系顯著。其回歸方程為：y=635.8095x+328.746（R=0.90742，F(xiàn)=18.6514）。x為PEG含量，用小數(shù)表示。Y為SOD酶活力，單位為U。

圖2 PEG干旱脅迫對GZUIFR-GL5-08i脯氨酸的影響Fig. 2 Effects of different PEG drought stress on proline content of GZUIFR-GL5-08i

圖3 PEG干旱脅迫對GZUIFR-GL5-08i SOD酶的影響Fig. 3 Effects of different PEG drought stress on SOD activity of GZUIFR-GL5-08i

2.4.3 PEG干旱脅迫對菌株GZUIFR-GL5-08i POD和CAT酶的影響

無論是原始菌株還是突變菌株P(guān)OD的酶活力，都在上升到10% PEG處后就不再增長。說明POD的酶活在15% PEG后增加不顯著且誘變株的活力整體要高于原始株。POD酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。因此它的含量增加有助于菌株提升抗旱性能。經(jīng)過線性回歸分析：誘變菌株的POD酶活力與PEG含量在25%的范圍內(nèi)線性回歸關(guān)系顯著。其回歸方程為：y=335.4666x+222.1222（R=0.823628，F(xiàn)=8.436406）。x為PEG含量，用小數(shù)表示。Y為POD酶活力，單位為U。

CAT的酶活力隨PEG濃度上升呈現(xiàn)出高斯曲線形狀。誘變菌株在15% PEG處達(dá)到高峰（94.7U），原始菌株在10% PEG處達(dá)高峰（68.71U）。誘變過后，CAT的酶活耐受干旱脅迫的強(qiáng)度略高于原始菌株，且CAT整體的酶活要高于原始株。CAT酶是可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。因此它的含量增加有助于菌株提升抗旱性能。

圖4 PEG脅迫對GZUIFR-GL5-08i POD酶的影響Fig. 4 Effects of PEG stress on POD activity of GZUIFR-GL5-08i

圖5 PEG脅迫對GZUIFR-GL5-08i CAT酶的影響Fig. 5 Effects of PEG stress on POD activity of GZUIFR-GL5-08i

3 討論

煙葉倉儲(chǔ)環(huán)境一直是蟲生真菌控蟲應(yīng)用的禁區(qū)，對于煙葉而言儲(chǔ)存醇化增質(zhì)是首要目標(biāo)，但是也要保證防蟲、控霉的前提?？刂泼咕鸵蟓h(huán)境要低濕度，而蟲生真菌產(chǎn)生防治效果往往需要較高的環(huán)境濕度，這就造成了菌株自身生理特點(diǎn)與實(shí)際環(huán)境的矛盾。解決這個(gè)問題，一方面利用菌種選育技術(shù)獲得能夠適應(yīng)倉儲(chǔ)環(huán)境并能發(fā)揮作用的菌株。同時(shí)也可考慮在倉儲(chǔ)大環(huán)境下建立局部高濕的小環(huán)境將煙草甲蟲吸引過來進(jìn)行防治[13]，該方法的問題是防治規(guī)模較小。另外煙草甲一旦爆發(fā)很難根治，其中一個(gè)重要原因就是其擴(kuò)散到了醇化庫不易殺蟲的小環(huán)境和倉庫周圍的大環(huán)境。在防治時(shí)出于成本考慮，往往都是密封垛小環(huán)境殺蟲而忽略周圍環(huán)境的蟲口減少。利用蟲生真菌防治煙葉倉儲(chǔ)周圍環(huán)境也是一個(gè)值得嘗試的技術(shù)手段。

4 結(jié)論

通過文中的結(jié)果可以看出，白僵菌的抗性機(jī)理與植物類似，在植物中其重要作用的抗逆酶類和脯氨酸在白僵菌中也與抗旱能力相關(guān)性密切。這些生理指標(biāo)可以做為蟲生真菌抗逆性菌株初步篩選和評(píng)估作參考。另外在自然界中還有許多待開發(fā)的蟲生真菌生物資源，由于蟲生真菌生活史中生殖方式的復(fù)雜性，導(dǎo)致同一個(gè)種內(nèi)的不同來源菌株之間差異顯著，這也為菌株資源的篩選提供了更廣闊的途徑。

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Screening and breeding of Beauveria bassiana for controlling tobacco beetles

ZHANG Xiaomin1, YANG Hui1, SHI Ming1,HU Daming1, LIU Aiying2, ZOU Xiao2,3
1 China Tobacco Guizhou Industrial CO.,LTD. Guiyang, 550000, China；2 Institute of Fungus Resources, Guizhou University, Guiyang, 550025, China；3 Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality Research, Guiyang, 550025, China

Screening and breeding of drought-resistant and high temperature-resistant Beauveria bassiana was conducted so as to make it adaptable in leaf tobacco warehouse. GZUIFR-GL5-08i strains were screened out through a combined ultraviolet and microwave mutagenic experiment. Results showed that GZUIFR-GL5-08i sustained stable growth on the condition of water potential 0.8Mpa and temperature 35℃. Content of protein, proiline, SOD, CAT, POD were higher than that before mutation, which showed similarity in draught-resistance mechanism between entomogenous fungi and plants.

pests in stored products; tobacco beetle; Beauveria bassiana; resistance mechanism

:ZHANG Xiaomin, YANG Hui, SHI Ming, et al. Screening and breeding of Beauveria bassiana for controlling tobacco beetles [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)

張曉敏，楊輝，施鳴,等. 防治煙草甲白僵菌的倉儲(chǔ)應(yīng)用菌株選育[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21（2）

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司計(jì)劃項(xiàng)目（黔煙工計(jì)：200907；201021））；貴州省煙草公司科技項(xiàng)目（黔煙科合：200921）

張曉敏（1965—），農(nóng)藝師，Email：zhangxm1983@126.com

鄒曉（1977—），Email：coprinus@126.com

2014-02-12