譚令辭，劉雄倫* ，楊婷婷，行 璇，梁 毅，陳海龍，楊豐宇，李永聰，劉金靈，戴良英，陳立云，王國梁

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128;2作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128;3中國種子集團有限公司，湖北武漢430206;4湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙410128)

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物，全球半數(shù)以上人口以稻米為主食［1］。由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(rice blast disease)是水稻最主要的真菌性病害之一，流行年份可使水稻減產(chǎn)10%～30%，是水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素［2］。實踐證明，利用廣譜、持久抗性基因培育和推廣抗病水稻品種是控制稻瘟病危害最經(jīng)濟和環(huán)保的有效措施［3，4］。然而，由于受多種因素的影響，在常規(guī)抗病育種中對表型的選擇往往不夠準(zhǔn)確，育種效率低。分子標(biāo)記輔助選擇(molecular markerassisted selection，MAS)育種，是通過基因型鑒定和分析對目標(biāo)性狀進行選擇，選擇效率大大提高，常用于連續(xù)回交育種定向改良受體個別性狀，且沒有轉(zhuǎn)基因生物安全性評價的繁瑣程序，是現(xiàn)代分子育種的重要手段［5，6］。Pi9是一個已克隆的廣譜、持久抗稻瘟病基因，位于水稻第6號染色體短臂靠近著絲粒位置［7，8］。本研究以秈稻品系 75－1－127作為Pi9基因供體親本，早秈稻品種1701作為受體親本及輪回親本，利用Pi9基因內(nèi)特異DNA分子標(biāo)記開展MAS育種，經(jīng)過連續(xù)多代回交并自交，獲得1個抗稻瘟病水稻新品系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Pi9基因供體秈稻親本及稻瘟病室內(nèi)接種抗病對照75－1－127;稻瘟病室內(nèi)接種感病對照水稻品種Co39;Pi9基因受體早秈稻親本1701(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻科學(xué)研究所培育);16份來自國內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株(表1)。以上材料均由本課題組收集保存。

1.2 方法

1.2.1 分子標(biāo)記的開發(fā)

Pi9屬于NBS－LRR類基因，含有2個內(nèi)含子，長度分別為5 362 bp和128 bp;cDNA全長4 009 bp，包括3 099 bp的編碼區(qū)和910 bp 3'UTR。本研究在Pi9基因第1個內(nèi)元序列中設(shè)計1個基于PCR技術(shù)的特異功能標(biāo)記Ins2－1(正向引物序列為5'－AACTGTTTTAAACACTCGGGTGGATA －3'，反向引物序列為5'－CACGATGATAACTTGGGCTAGGG CG－3')，分析Ins2－1在75－1－127和1701之間的多態(tài)性，并利用它對各回交世代及BC6F2自交群體進行基因型選擇。

1.2.2 模板DNA的提取與標(biāo)記基因型鑒定

對供體、受體親本及回交或自交群體候選單株，各取約0.2 g新鮮幼嫩葉片置于2.0 mL離心管中液氮研磨，CTAB 法［9］提取總 DNA。

利用Ins2－1標(biāo)記引物對各DNA樣品做PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系(10 μL):DNA 模板1.0 μL，5 U/μL r－ Taq 0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL Primer pairs 1.0 μL，10 Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 50 s，50℃退火 50 s，72℃延伸 40 s，35 個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳并分析其帶型。

1.2.3 分子標(biāo)記Ins2－1的選擇效率分析

2014年，將1701×75－1－127的 BC6F1群體及雙親播種于瀏陽大圍山病圃，使其自然發(fā)病，5葉期調(diào)查BC6F1單株苗瘟獲得抗性表型，同時用Ins2－1鑒定對應(yīng)單株的標(biāo)記基因型，以此分析和檢驗分子標(biāo)記Ins2－1對表型的選擇效率。

1.2.4 BC6F2群體主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

用Ins2－1對1701×75－1－127的BC6F1群體中隨機單株做基因型鑒定，將Pi9基因的陽性單株套袋自交并混合收種，構(gòu)成BC6F2改良群體。為確定BC6F2代的遺傳背景是否已接近受體親本，需要比較BC6F2群體與受體親本1701的主要農(nóng)藝性狀。2014年，2個群體各隨機選取10株定點調(diào)查分析，所調(diào)查的農(nóng)藝性狀包括全生育期、株高、劍葉長寬比、穗長、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重。記載標(biāo)準(zhǔn)參照文獻［10］。相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件處理分析。

1.2.5 分子標(biāo)記輔助選擇育種獲得抗病純系

用Pi9基因供體親本75－1－127與受體親本1701雜交獲得F1代，用受體親本1701作輪回親本連續(xù)回交獲得各回交世代。每代于田間種植約20株，苗期分單株編號取樣并提取總DNA，用分子標(biāo)記Ins2－1做各單株基因型鑒定，并結(jié)合田間綜合農(nóng)藝性狀選擇確定5～10個候選單株，用于與輪回親本回交并混合收種。通過2009～2013年長沙—三亞兩地穿梭育種獲得1701×75－1－127的BC6F2群體，于2014年夏季在長沙單株播種，再次利用分子標(biāo)記Ins2－1輔助選擇獲得Pi9陽性單株，各單株套袋自交獲得BC6F3株系。對各BC6F3株系做標(biāo)記基因型和抗病性分析，篩選抗稻瘟病純系。

1.2.6 室內(nèi)接種表型鑒定

用于室內(nèi)接種抗菌譜分析的水稻材料包括75－1－127、1701及感病對照 Co39，稻瘟菌菌株16份。用于1701×75－1－127各BC6F3株系表型鑒定的稻瘟菌菌株為87－4。供試材料播種于裝有營養(yǎng)土的32孔塑料連板(20 cm×15 cm×30 cm)中，人工氣候室溫度26～28℃，正常光照培養(yǎng)至4葉期。采用單個菌株約1×105個/mL濃度的孢子懸浮液活體噴霧接種后，經(jīng)過26℃高濕暗培養(yǎng)24 h，再進行5～6 d的正常光照高濕培養(yǎng)。參照Bonman的0～5級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情(0～2級為抗病類型，3～5級為感病類型)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試親本水稻的稻瘟病抗性表現(xiàn)與抗菌譜

利用16份來自國內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株分別對供體親本、受體親本及感病對照室內(nèi)接種，獲得的抗性表現(xiàn)和抗菌譜結(jié)果如表1。各供試材料的抗性表現(xiàn)和抗菌譜差異顯著，Pi9基因供體親本75－1－127對來自國內(nèi)不同省份的14份菌株均表現(xiàn)抗病，但不抗來自韓國的ROR1和來自日本的KOH，抗性頻率為87.5%;受體親本1701對包括ROR1和KOH在內(nèi)的8份菌株表現(xiàn)感病，對來自國內(nèi)的6份菌株(E2007046A、RB6、X2007A －1、CHL645、RB14、195－2－2)表現(xiàn)抗病，抗性頻率為37.5%，表明其稻瘟病抗性確需改良;兩親本在8份菌株的抗性表現(xiàn)上存在差異，可用于MAS育種的表型驗證;感病對照Co39對所有供試菌株均表現(xiàn)感病。

表1 供試水稻材料的稻瘟病菌抗譜Table 1 Resistance spectrum of the tested rice line to sixteen M.oryzae isolates

2.2 分子標(biāo)記Ins2－1的多態(tài)性與選擇效率

用分子標(biāo)記Ins2－1分別對供體和受體親本的基因組DNA模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析標(biāo)記基因型，結(jié)果在75－1－127基因組中擴增出1條532 bp的清晰條帶，而在1701基因組中無擴增產(chǎn)物，說明Ins2－1是1個在雙親間多態(tài)性明顯且穩(wěn)定的顯性DNA分子標(biāo)記，可用它開展MAS育種改良受體稻瘟病抗性。

為檢驗Ins2－1標(biāo)記基因型在MAS育種中對稻瘟病抗性表型的選擇效率，將1701×75－1－127 BC6F1群體播于田間病圃發(fā)病后，隨機選取單株調(diào)查分析其表型與基因型。結(jié)果在Pi9基因供體75－1－127和所有BC6F1抗病單株中均擴增出1條532 bp的清晰條帶，而在受體親本1701和所有感病單株中均無擴增產(chǎn)物(圖1)，表明本試驗中Ins2－1標(biāo)記基因型對回交后代的表型選擇效率為100%。

圖1 分子標(biāo)記Ins2－1對1701×75－1－127 BC6F1群體的表型選擇效率Fig.1 Phenotypic selection efficiency of molecular marker Ins2－1 for 1701×75－1－127 BC6F1population

2.3 BC6F2群體的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

1701×75－1－127的BC6F2群體與受體親本1701的主要農(nóng)藝性狀調(diào)查分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明，2個群體在生育期、株高、株葉形、產(chǎn)量構(gòu)成因素等主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)上均無顯著性差異，說明通過連續(xù)多代回交與自交，BC6F2改良群體的遺傳背景已經(jīng)與受體親本非常接近，即它們實際上已是近等基因系(除Pi9基因差異)。

表2 1701×75－1－127 BC6F2群體及1701主要農(nóng)藝性狀分析Table 2 Analysis of the agronomic characteristics of 1701×75－1－127 BC6F2population and 1701

2.4 抗稻瘟病水稻純系的鑒定與篩選結(jié)果

用分子標(biāo)記 Ins2－1鑒定1701×75－1－127 BC6F2群體中的單株基因型，確定含有Pi9基因的單株套袋自交獲得數(shù)個BC6F3株系。為明確各BC6F3株系中Pi9基因是否已經(jīng)純合，繼續(xù)用Ins2－1進行基因型鑒定，同時用稻瘟菌菌株87－4室內(nèi)接種分析抗性表型是否分離，結(jié)果獲得1個基因型和表型均無分離的抗病純系(圖2)。該株系的遺傳背景已與受體親本1701非常接近，主要農(nóng)藝性狀與1701無顯著差異，暫命名為“抗瘟1701”，為進一步培育抗稻瘟病水稻新品種(組合)打下了基礎(chǔ)。

圖2 稻瘟病抗病純系的基因型和表型鑒定Fig.2 A blast resistant rice pure line was identified by genotypic and phenotypic analyses

3 小結(jié)與討論

在常規(guī)抗稻瘟病育種中，由于環(huán)境等多種因素的影響，對表型的選擇往往不夠準(zhǔn)確，育種效率低。MAS育種是通過標(biāo)記基因型分析和選擇代替表型選擇，選擇準(zhǔn)確性和育種效率大大提高。筆者利用已克隆的廣譜、持久抗瘟基因Pi9的序列信息，開發(fā)出1個基因內(nèi)特異功能標(biāo)記Ins2－1，用它開展MAS育種，定向改良一些感病水稻品種(特別是雜交稻親本)的稻瘟病抗性［12～14］。實踐證明，分子標(biāo)記Ins2－1在Pi9供體親本75－1－127與多份待改良的受體親本間存在明顯穩(wěn)定的多態(tài)性，可利用它同時改良各受體的稻瘟病抗性。本研究中，Ins2－1標(biāo)記基因型對抗病性表型的選擇效率為100%，利用該標(biāo)記在各回交及自交世代中連續(xù)輔助選擇，育成了1個抗病純系“抗瘟1701”，為培育抗病水稻新品種(組合)打下了基礎(chǔ)。

Ins2－1是1個顯性標(biāo)記，不能區(qū)分抗病純合子與雜合子。我們將基于Pi9基因的序列特點開發(fā)新的共顯性標(biāo)記，進一步提高MAS育種效率。本研究獲得的抗病純系“抗瘟1701”，還需進一步鑒定其抗菌譜以及在不同稻區(qū)的田間抗性。雖然Pi9基因是一個廣譜、持久抗性基因，但它對來自韓國的菌株ROR1和來自日本的菌株KOH沒有抗性。下一步將利用抗菌譜不同的另一廣譜抗性等位基因Pigm［14］，先將2個等位基因非等位化，再進行雙基因聚合育種，以培育抗譜更廣、抗性更強的水稻新品種。

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