李東 黃曉翔 袁捷 俞哲元 徐梁 徐海淞 韋敏

Periostin對自體脂肪移植成活率的影響

李東 黃曉翔 袁捷 俞哲元 徐梁 徐海淞 韋敏

目的 探索Periostin復(fù)合自體脂肪顆粒移植后，對移植脂肪血管化及成活率的影響，以明確Periostin在自體脂肪移植中的作用。方法 體外實驗驗證低氧條件下Periostin對脂肪干細(xì)胞成血管的影響，RT-PCR檢測CD133及CD144的基因表達(dá)情況；將Periostin復(fù)合自體脂肪組織移植到裸鼠體內(nèi)，觀察移植脂肪的成活情況。結(jié)果 在低氧條件下，Periostin組細(xì)胞成血管能力明顯優(yōu)于空白對照組；RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Periostin組的CD133和CD144表達(dá)量明顯高于空白對照組；Periostin復(fù)合自體脂肪移植后1、3、6個月，移植脂肪成活率分別為79.50%±3.70%、67.71%±4.08%和64.78%±5.78%，明顯高于對照組（51.83%±5.97%、39.45%±10.32%和34.20%±10.61%）。結(jié)論 Periostin能夠改善脂肪移植早期組織對缺氧的耐受性，促進(jìn)自體脂肪顆粒移植后的早期血管化，有利于移植脂肪顆粒的存活，可有效改善脂肪移植的成活率。

脂肪移植 成活率 低氧 骨膜蛋白

各種畸形、創(chuàng)傷、腫瘤切除等造成的機(jī)體軟組織缺損，嚴(yán)重影響患者的身心健康，對其進(jìn)行修復(fù)和重建是整復(fù)外科的重要內(nèi)容[1-2]。自體脂肪組織作為軟組織填充材料，具有來源充足，獲取簡單，供區(qū)創(chuàng)傷較小，不產(chǎn)生免疫排斥等優(yōu)點。但是，自體脂肪移植術(shù)后常出現(xiàn)脂肪的吸收、感染、液化壞死、鈣化以及囊腫等并發(fā)癥[3-4]，導(dǎo)致移植脂肪成活率低下，嚴(yán)重限制了自體脂肪移植的臨床應(yīng)用。

目前，普遍認(rèn)為導(dǎo)致移植脂肪組織成活率低的最主要因素是移植微環(huán)境的缺血缺氧[1]，文獻(xiàn)報道指出，脂肪組織對低氧刺激十分敏感，如果氧分壓持續(xù)低于其所能耐受的最低值，脂肪組織細(xì)胞很快就會死亡[5]，從而導(dǎo)致多種并發(fā)癥。

Periostin（骨膜蛋白），是一種分泌型的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以為細(xì)胞的生存提供微環(huán)境。有研究表明，Periostin能抑制低氧、低營養(yǎng)等應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[6]。此外，Periostin還與內(nèi)皮細(xì)胞遷移的趨化性和趨觸性密切相關(guān)[7]。本研究探索Periostin復(fù)合自體脂肪顆粒移植后對移植脂肪血管化及成活率的影響，明確Periostin在自體脂肪移植中的作用。

1 材料及方法

1.1 實驗試劑及器材

DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清，0.25%胰蛋白酶 （GIBCO，美國）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific，美國）；無菌超凈工作臺（上海博訊實驗器材有限公司）。

1.2 實驗動物

先天性無胸腺小鼠30只，4～6周齡，雄性（我院實驗動物中心提供）。

1.3 脂肪來源

脂肪來源于健康的吸脂患者，女性，年齡22～41歲，均獲患者知情同意。

1.4 實驗方法

1.4.1 脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

獲取的脂肪PBS洗滌2～3遍，修剪成1 mm3大小的顆粒，加入等體積的1.5 mg/mL NB4膠原酶，于37℃恒溫?fù)u床上消化60 min，消化后離心、重懸過濾，并接種于培養(yǎng)皿；根據(jù)生長情況定期傳代，細(xì)胞純化后對其干性進(jìn)行鑒定。

1.4.2 Periostin在低氧條件下對脂肪干細(xì)胞的成血管作用的影響

制備培養(yǎng)基，分別為100 ng/mL Periostin蛋白組、50 ng/mL VEGF因子組（陽性對照組）和空白對照組；將細(xì)胞接種到含matrigel的24孔板，37℃低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄，對各組成血管情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4.3 Periostin對脂肪干細(xì)胞基因表達(dá)的影響

低氧細(xì)胞培養(yǎng)及勻漿液制備：低氧培養(yǎng)10 d后，去上清，加入Trizol細(xì)胞裂解液，每10 cm2面積加1 mL，裂解細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿；提取RNA并行RTPCR檢測，檢測CD133及CD144的基因表達(dá)情況。

1.4.4 Periostin對自體脂肪移植成活率的影響

將抽脂獲取的脂肪顆粒洗凈，剪碎后分別與Periostin（Periostin組）及VEGF（VEGF組，陽性對照組）混合，并設(shè)立空白對照組；將實驗鼠麻醉后，用18號針頭將1 mL脂肪顆粒移植到實驗鼠皮下，局部按壓3～5 min，表面涂抹紅霉素眼膏；術(shù)后單獨分籠飼養(yǎng)，防止相互撕咬。術(shù)后第2天，觀察裸鼠的成活及傷口情況。術(shù)后不同時間點取材，排水法檢測存留的脂肪體積，動態(tài)觀察各組移植脂肪的成活情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，成管的數(shù)目、基因表達(dá)變化、術(shù)后存活率的比較采用t檢驗及方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

人脂肪干細(xì)胞經(jīng)膠原酶消化后接種培養(yǎng)，2～3 h后可有少量細(xì)胞貼壁，傳代培養(yǎng)至第3代后鏡下觀察，脂肪干細(xì)胞呈形態(tài)均一的長梭形，細(xì)胞呈旋渦狀生長，放射狀排列，細(xì)胞狀態(tài)良好。細(xì)胞經(jīng)干性鑒定為脂肪干細(xì)胞（圖1、2）。

圖1 脂肪干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（標(biāo)尺：50 μm）Fig.1 Morphology of adipose stem cells(Scale:50 μm)

圖2 多向誘導(dǎo)分化潛能（標(biāo)尺：50 μm）Fig.2 The potential ability of multi-differentiation (Scale:50 μm)

2.2 Periostin對ASC細(xì)胞成血管的影響

鏡下可見，隨著誘導(dǎo)時間的延長，各組成血管差異越來越明顯。3 d時部分細(xì)胞團(tuán)塊有“出芽”現(xiàn)象，以Periostin組及VEGF組出芽現(xiàn)象最為明顯，而空白對照組的出芽現(xiàn)象尚不明顯。9 d時，Periostin組相互之間的網(wǎng)絡(luò)狀連接較VEGF組更為發(fā)達(dá)，說明在重組蛋白Periostin的誘導(dǎo)刺激下，脂肪干細(xì)胞的成管能力較強(qiáng)（圖3）。

圖3 低氧條件下各組成血管情況（40×）Fig.3 The condition of tabulation in each group under hypoxia(40×)

統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Periostin及VEGF組在低氧條件下誘導(dǎo)ASC成血管的能力較空白對照組更強(qiáng)，其中Periostin在第9天誘導(dǎo)成血管形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)強(qiáng)于 VEGF陽性對照組 （P<0.05），而 Periostin及VEGF組均明顯強(qiáng)于空白對照組（P<0.05）（圖4）。

圖4 低氧條件下ASCs成血管統(tǒng)計（*：P<0.05，vs空白對照組；#：P<0.05，vs Periostin組）Fig.4 The statistics of tabulation of ASCs under hypoxia (*:P<0.05,vs blank control group;#:P<0.05,vs Periostin group)

2.3 Periostin對ASCs基因表達(dá)的影響

低氧條件誘導(dǎo)7 d后，RT-PCR檢測CD133（內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)抗原）、CD144（成熟內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原）基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CD133及CD144在Periostin組的表達(dá)量與VEGF陽性對照組相當(dāng)（P>0.05），在空白對照組的表達(dá)量最低（P<0.05）（圖5）。

圖5 低氧誘導(dǎo)后各組CD133、CD144基因表達(dá)Fig.5 Gene expression of CD133 and CD144 in each group under hypoxia

2.4 移植脂肪的大體形態(tài)觀察及存活率分析

術(shù)后不同時間點取材觀察移植脂肪的大體形態(tài)，各組移植脂肪的體積變化呈一定的規(guī)律性。一般在移植術(shù)后早期，移植脂肪區(qū)域表現(xiàn)為體積略有增大，為炎性腫脹，隨著炎性腫脹的消退，移植脂肪的體積逐漸變小，此為脂肪組織被吸收的表現(xiàn)。

移植術(shù)后2周，不同組別移植脂肪的體積差異較大。單純脂肪顆粒組（空白對照）吸收較明顯，而Periostin+脂肪顆粒移植組，VEGF+脂肪顆粒組吸收相對緩慢，但均有不同程度的液化壞死；移植術(shù)后4周，單純脂肪顆粒組殘留脂肪體積最小，伴有較明顯的液化壞死，其他兩組吸收程度輕并未見明顯的液化壞死（圖6）。

圖6 移植脂肪組織的大體形態(tài)Fig.6 General observation of transplanted adipose tissue

圖7 移植脂肪的成活率Fig.7 The survival rate of transplanted fat

脂肪移植術(shù)后不同時間點取材，立即用排水法測量術(shù)后存留的脂肪體積。移植術(shù)后1、3、6個月，單純脂肪顆粒組脂肪存活率分別為51.83%±5.97%、39.45%±10.32%和34.20%±10.61%；Periostin復(fù)合脂肪顆粒移植組成活率分別為 79.50%±3.70%、67.71%±4.08%和64.78%±5.78%；VEGF復(fù)合脂肪顆粒移植組的成活率分別為68.33%±4.50%、52.86%± 6.37%和49.71%±7.76%。上述結(jié)果采用單因素方差分析比較，結(jié)果顯示，術(shù)后1、3、6個月，三組之間比較，兩兩之間均有顯著差異（P<0.05）（圖7）。

3 討論

目前有關(guān)自體脂肪移植的報道均認(rèn)為脂肪移植后易出現(xiàn)不同程度的液化壞死[8-13]，大多數(shù)移植脂肪組織液化壞死都是由于移植后缺血缺氧導(dǎo)致的[5]。因此,我們試圖改善脂肪移植后缺血、缺氧的情況，并提高移植組織對低氧的耐受性，以促進(jìn)移植脂肪的成活。

為明確Periostin在低氧條件下誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的成血管作用，本實驗首先分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞并行干性鑒定，然后將脂肪干細(xì)胞接種在已鋪matrigel的24孔板中，并于低氧條件下培養(yǎng)，定期觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第3天空白對照組、Periostin組及VEGF組三者無明顯差異。我們認(rèn)為這是因為細(xì)胞在低氧環(huán)境下適應(yīng)需要一個過程，因此各個組別的差異并不顯著。在隨后的觀察中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，Periostin組、VEGF組的細(xì)胞相互連接形成了更多的不同大小管腔的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，其中Periostin組成血管的數(shù)目更多。說明Periostin與VEGF一樣，具有在低氧條件下促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞形成血管的功能。隨著低氧誘導(dǎo)時間的延長，Periostin組的細(xì)胞耐受缺氧的能力逐漸表現(xiàn)出來，說明在體外條件下，Periostin的確能夠提高細(xì)胞對缺氧的耐受性，同時具有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞形成血管的能力。

RT-PCR檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原CD133、CD144基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Periostin組、VEGF組的CD133、CD144表達(dá)量均高于空白對照組。這說明Periostin及VEGF能夠有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原的表達(dá)，其對促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有積極作用。

以上體外實驗的結(jié)果提示，在低氧條件下，Periostin有助于提高脂肪干細(xì)胞對缺氧的耐受性，可以促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化并成血管，達(dá)到甚至超過了VEGF陽性對照組的效果。

通過進(jìn)一步的體內(nèi)實驗，我們發(fā)現(xiàn)Periostin能夠有效提高移植脂肪的成活率，其作用可能是通過提高移植早期組織細(xì)胞對低氧的耐受性和促進(jìn)移植脂肪的血管化來實現(xiàn)的。本實驗研究結(jié)果對于提高移植脂肪的成活率具有重要意義，亦可推廣應(yīng)用于低氧或缺血引起的各種病理狀態(tài)。但是其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

4 總結(jié)

本實驗證實Periostin能夠促進(jìn)移植脂肪的成活，可能是通過促進(jìn)移植脂肪的血管化和提高了組織細(xì)胞對移植后低氧的耐受性兩方面實現(xiàn)的。Periostin作為促進(jìn)移植脂肪成活的新的因子，對其進(jìn)行深入研究具有重要的臨床應(yīng)用價值。

[1] Patrick CJ.Tissue engineering strategies for adipose tissue repair [J].Anat Rec,2001,263(4):361-366.

[2] Patrick CJ.Adipose tissue engineering:the future of breast and soft tissue reconstruction following tumor resection[J].Semin Surg Oncol,2000,19(3):302-311.

[3] Rao A,Saadeh PB.Defining fat necrosis in plastic surgery[J]. Plast Reconstr Surg,2014,134(6):1202-1212.

[4] Carvajal J,Patino JH.Mammographic findings after breast augmentation with autologous fat injection[J].Aesthet Surg J, 2008,28(2):153-162.

[5] 趙建輝.移植脂肪的成活及干細(xì)胞對其促進(jìn)作用的研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學(xué),2012.

[6] Bao S,Ouyang G,Bai X,et al.Periostin potently promotes metastatic growth of colon cancer by augmenting cellsurvival via the Akt/PKB pathway[J].Cancer Cell,2004,5(4):329-339.

[7] Lamalice L,Le Boeuf F,Huot J.Endothelial cell migration during angiogenesis[J].Circ Res,2007,100(6):782-794.

[8] Alencar JC,Andrade SH,Pessoa SG,et al.Autologous fat transplantation for the treatment of progressive hemifacial atrophy (Parry-Romberg syndrome:case report and review of medical literatute)[J].An Bras Dermatol,2011,86(4 Suppl 1):S85-S88.

[9] Hu J,Yin L,Tang X,et al.Combined skeletal and soft tissue reconstruction for severe Parry-Romberg syndrome[J].J Craniofac Surg,2011,22(3):937-941.

[10] Yoshimura K,Sato K,Aoi N,et al.Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation:supportive use of adipose-derived stem/stromal cells[J].Aesthetic Plast Surg,2008,32(1):48-55.

[11] Rosing JH,Wong G,Wong MS,et al.Autologous fat grafting for primary breast augmentation:a systematic review[J].Aesthetic Plast Surg,2011,35(5):882-890.

[12] Marcus BC.The use of autologous fat for facial rejuvenation[J]. Obstet Gynecol Clin North Am,2010,37(4):521-531.

[13] Buckingham ED,Glasgold R,Kontis T,et al.Volume rejuvenation of the facial upper third[J].Facial Plast Surg,2015,31(1):43-54.

Effect of Periostin on the Survival Rate of Autologous Fat Transplantation

LI Dong,HUANG Xiaoxiang,YUAN Jie,YU Zheyuan,XU Liang,XU Haisong,WEI Min.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WEI Min (E-mail:drweimin@163.com).

Objective To explore the effect of Periostin on the vascularization and survival rate of autologous fat transplantation,and to find out the role of Periostin in autologous fat transplantation.Methods The special effect of Periostin in inducing vascularization of adipose stem cells under hypoxia was observed in vitro.The expression of CD133 and CD144 of ASCs under hypoxia were tested by RT-PCR.Then,the adipose tissue compounded with Periostin was transplanted into nude mice,and the survival rate of the transplanted fat tissue was detected at different time points after transplantation. Results Periostin group showed a higher vascularization degree under hypoxia,compared with blank control group.The expression of CD133 and CD144 of ASCs under hypoxia in Periostin group were higher than in blank control group.Periostin composite with autologous fat transplantation improved the survival rate of fat transplantation at each time point(79.50%± 3.70%,67.71%±4.08%,64.78%±5.78%),which were better than simple autologous fat transplantation (51.83%±5.97%, 39.45%±10.32%,34.20%±10.61%).Conclusion Periostin is able to improve fat survivability under hypoxia during the early stage,and promote the early stage vascularization of autologous fat granules after transplantation,which is beneficial to the survival of the transplanted fat tissue.

Fat transplantation;Survival rate;Hypoxia;Periostin

R622+.9

A

1673－0364（2015）06－0358－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.003

2015年8月9日；

2015年9月27日）

國家自然科學(xué)基金（81471886）；上海市科委重點項目（134119a2000）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

韋敏（E-mail：drweimin@163.com）。