孫秀梅，鄭祎

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濰坊 261000）

·論著·

黃連素對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孫秀梅，鄭祎

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濰坊 261000）

目的探討黃連素（berberine）對人肺腺癌細(xì)胞株A549的作用及其機(jī)制。方法將對數(shù)生長期A549細(xì)胞分成對照組和黃連素組。對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，黃連素組細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入黃連素100μmol/L。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，利用MTT檢測細(xì)胞增殖；流式檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR檢測細(xì)胞JAK2和STAT3 mRNA水平；Western blot檢測細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的變化。結(jié)果與對照組相比，黃連素組A549細(xì)胞增殖率明顯下降（P＜0.05），凋亡率明顯升高，A549細(xì)胞JAK2與STAT3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測顯示，黃連素組A549細(xì)胞JAK2和STAT總蛋白無明顯變化（P＞0.05），但p-JAK2和p-STAT3總蛋白明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論黃連素能抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過激活JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

黃連素；A549細(xì)胞；增殖；凋亡；JAK2/STAT3

20世紀(jì)60年代以來，化療藥物治療肺癌獲得巨大成功，推動了國內(nèi)外腫瘤治療，但有研究和臨床發(fā)現(xiàn)化療藥物容易引起嚴(yán)重的副作用，如急性肝損傷、急性腎損傷等，若不及時診治可危及生命[1]。因此，尋找新的高效低毒分化誘導(dǎo)劑與分化療法，已成為腫瘤基礎(chǔ)與臨床學(xué)者研究的重點(diǎn)之一。目前，中藥誘導(dǎo)分化的研究尚不多見。黃連素是我國應(yīng)用已久的一種中藥，又稱小檗堿（berberine），是從黃連、黃柏等中藥中提取的季銨類化合物，以往臨床上主要用來清熱解毒，抗菌消炎[2]。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[3-5]。同時，肺癌的發(fā)生被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖平衡失調(diào)的結(jié)果[6]。本研究以人肺腺癌A549為靶細(xì)胞，探討黃連素對人肺腺癌細(xì)胞株A549的作用及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1藥品與試劑

A549（武漢病毒研究所），黃連素（武漢銀河生物制藥有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibgo公司），小牛血清（杭州四季青公司），12孔培養(yǎng)板（美國Falcon公司），β-actin抗體（Abmart，China），p-JAK2抗體（CST，USA），JAK2抗體（CST，USA）p-STAT3抗體（CST，USA），STAT3抗體（CST，USA）。TRIzol reagent（Invitrogen，USA），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Gene Copoeia，USA），SYB R green（Takara，Japan），Q-PCR儀（BIO-RAD），蛋白裂解液RIPA（碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白酶抑制劑cocktail及Western blot凝膠制備試劑盒（武漢谷歌生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。qPCR引物（擎科生物技術(shù)有限公司），酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加入青霉素（100 u/ml）和鏈霉素（100 u/ml），在37℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司），倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）。PVDF膜（Roche），ECL試劑盒（Bi-pech），膠片及化學(xué)發(fā)光儀（Kodak），實(shí)時定量RT-PCR儀（BIO-RAD）。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，接種于12孔板內(nèi)，調(diào)整密度為2×105個/ml，每孔90μl，實(shí)驗(yàn)組加入黃連素（100μmol），對照組細(xì)胞不加藥物，另設(shè)空白組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和藥物），每組均設(shè)3個復(fù)孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，加入5mg/ml的MTT溶液20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入三聯(lián)裂解液[10%SDS+5%異丁醇+1%鹽酸（10 mol/L），100μl/孔]，37℃放置過夜后，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處讀取吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值]/[對照孔OD值-空白孔OD值]×100%。

1.5Annexin-V雙染法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整密度為1×105個/ml。實(shí)驗(yàn)分為兩組：對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；黃連素組細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入黃連素，終質(zhì)量濃度為0.4 g/L。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集各組所有懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，取1 ml細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去培養(yǎng)基，加RNA酶，37℃水浴1h，放入冰浴加入0.5mg/L碘化丙啶（PI）及Annexin V，流式細(xì)胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.6Western bIot檢測黃連素細(xì)胞JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3表達(dá)

將各組收集的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，將各組蛋白濃度調(diào)成一致，沸水煮5 min，待用。取各組細(xì)胞總蛋白樣品80μg，以樣品中的βactin為內(nèi)參，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1∶1 000），p-JAK2（1∶500），STAT3（1∶1 000），p-STAT3（1∶500），β-actin（1∶3 000）抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根據(jù)一抗的來源，再分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶500）、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶5 000）室溫下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。用Gel Pro Analy zer（Ver 3.0）軟件測定蛋白條帶灰度值JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3條帶灰度值與β-

actin內(nèi)參條帶灰度值的比值分別將上述蛋白表達(dá)量化。

1.7RT-PCR PCR檢測JAK2和STAT3 mRNA水平

按照總RNA提取試劑盒（TaKaRa）說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)時定量PCR。引物均由invitrogen公司合成。管家基因βactin作為內(nèi)參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。RT-PCR檢測的引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測的引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，資料用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本之間的兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1黃連素對A549細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照相比，給予黃連素的實(shí)驗(yàn)組增殖率明顯降低（P＜0.01）。對照組和黃連素組增殖率分別為（89±6）%和（45±5）%。見圖1。

圖1 MTT檢測黃連素對A549細(xì)胞增殖的影響

2.2黃連素對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照相比，給予黃連素的實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯增高（P＜0.001）。對照組和黃連素組凋亡率分別為（8±3）%和（55±10）%。見圖2。

圖2 流式檢測黃連素對A549細(xì)胞凋亡的影響

2.3黃連素對A549細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA的表達(dá)水平與黃連素處理組相比，差

異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 RT-PCR檢測黃連素對A549細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響

2.4黃連素對A549細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測顯示，與對照組比較，經(jīng)黃連素作用A549細(xì)胞24 h后，JAK2、STAT3蛋白無明顯變化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Western bIot檢測黃連素對A549細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，肺癌治療大多采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療和手術(shù)切除，但不良反應(yīng)大，尤其對肝臟和腎臟很大損害，且復(fù)發(fā)率高[1]。從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中挖掘抑制肺癌細(xì)胞惡性增殖的方法是研發(fā)高效低毒的抗肺癌藥物的有效途徑之一[2]。黃連素是臨床常用的一種中藥，目前研究發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖的作用[2-5]。近年來研究表明，肺癌不僅是增殖、分化異常的疾病，同時也是凋亡異常的疾病，細(xì)胞凋亡的減少可引起肺癌的發(fā)生，且通過逃避凋亡而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[6]。

JAK2/STAT3是多種細(xì)胞發(fā)揮介導(dǎo)作用的信號通路，信號通路涉及細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡（促凋亡）、細(xì)胞周期進(jìn)程、分化、轉(zhuǎn)錄、翻譯和糖代謝[7]。研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3信號通路可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖[7]、分化和凋亡，尤其與肺癌密切相關(guān)[8-10]。

筆者通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)黃連素可以明顯抑制A549細(xì)胞增殖，流式發(fā)現(xiàn)黃連素明顯增加A549細(xì)胞凋亡率。Western blot發(fā)現(xiàn)JAK2和STAT3明顯活化，因此可以推測黃連素可以通過激活JAK2/STAT3

信號通路下調(diào)增殖，促進(jìn)凋亡，從而達(dá)到治療肺癌的目的。

綜上所述，黃連素可能是通過激活JAK2/STAT3信號通路來抑制NCI-H446細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。但是黃連素是否直接作用于JAK2信號分子還是通過調(diào)節(jié)其上游激酶和/或信號分子而間接發(fā)揮作用仍不清楚，尚需進(jìn)行更深入的研究。

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（張蕾 編輯）

EEffect of Berberine on proliferation and apoptosis of A549 cells

Xiu－mei SUN,Yi ZHENG
(Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang,Shandong 261000,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of Berberine on the human lung adenocarcinoma cell line A549 and its mechanisms.【Methods】The A549 cells at logarithmic growth phase were divided into control and Berberine groups.The cells in the control group were normally treated and the cells in the Berberine group were incubated with Berberine(100 μmol/L).MTT and flow cytometry were used to examine the proliferation and apoptotic changes of A549 cells respectively in both groups after incubation for 24 h.The mRNA levels of JAK2 and STAT3 were detected by RT－PCR.The changes of JAK2,STAT3,p－JAK2 and p－STAT3 proteins were detected by Western blot.【Results】Compared with the control group,the proliferation rate of A549 cells was significantly decreased(P＜0.05),but the apoptotic rate was significantly increased in the Berberine group(P＜0.05).There were no differences in the mRNA levels of JAK2 and STAT3 between both groups(P＞0.05).Western blot showed that there was no difference in the expression of total JAK2 or STAT3 protein between both groups(P＞0.05),but the Berberine group had higher expression levels of p－JAK2 and p－STAT3 proteins than the control group(P＜0.05).【Conclusions】Berberine could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of A549 cells,and the effect may be achieved through activating JAK2/STAT3 signal transduction pathway.

Berberine;A549 cell;proliferation;apoptosis;JAK2/STAT3

R734.2

A

1005-8982（2015）24-0009-05

2015-03-18

鄭祎，Tel：15866537933