劉俊斌，吳衛(wèi)紅，靳君華

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診辦公室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

·論著·

蒲葵子乙醇提取物對人肝癌BeI-7402細(xì)胞增殖和遷移的影響

劉俊斌1，吳衛(wèi)紅2，靳君華1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診辦公室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

目的研究蒲葵子乙醇提取物（EELC）對人肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法將培養(yǎng)的Bel-7402細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對照組、150μg/ml EELC處理組、300μg/ml EELC處理組、10μmol/L Notch抑制劑DAPT處理組和10μg/ml抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體處理組，分別處理后，采用MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖和遷移能力的變化，Western blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）及Notch胞內(nèi)片段（NICD）等蛋白表達(dá)的變化，ELISA檢測各組細(xì)胞分泌VEGF水平的變化。結(jié)果不同濃度EELC、DAPT和抗VEGF抗體處理Bel-7402細(xì)胞后，Notch-VEGF途徑相關(guān)的VEGF、MMP-2、NICD等蛋白表達(dá)水平、VEGF分泌量、細(xì)胞的增殖和遷移能力均受到不同程度地抑制（P＜0.05）。而且EELC的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性和時間依賴性。結(jié)論蒲葵子乙醇提取物可通過Notch-VEGF途徑抑制人肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖和遷移。

蒲葵子；人肝癌細(xì)胞系；Notch-VEGF；增殖；遷移

蒲葵子為棕櫚科蒲葵的種子，味淡，性平，甘澀，微毒。南方民間有用蒲葵子治療癌癥的歷史，現(xiàn)也已有不少關(guān)于蒲葵子抗癌活性和抗血管生成作用的相關(guān)研究報道[1-3]，尤其是蒲葵子的乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[4]。肝癌是全球第三大致死癌癥，具有惡性程度高，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[5]。目前，在肝癌診治方面已取得較大進(jìn)展，但關(guān)于肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

大量研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展總是伴隨著新生血管的形成，如果沒有新血管的形成，腫瘤會處于生長抑制狀態(tài)，甚至發(fā)生退化。如今，腫瘤轉(zhuǎn)移中的血管生成已作為抗癌治療的一個重要靶點(diǎn)，尤其在阻斷Notch和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路方面[6]。Notch和VEGF通路的相互作用方式為相互調(diào)節(jié)，既有區(qū)別，又協(xié)同[7]。關(guān)于Notch和VEGF通路參與肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的研究已有相關(guān)報道，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提示，蒲葵子可通過下調(diào)Notch通路來抑制肝癌轉(zhuǎn)移的血管生成[4]，而關(guān)于蒲葵子針對肝癌細(xì)胞遷移機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究少有報道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以人肝癌細(xì)胞系Bel-7402為研究對象，在不同濃度蒲葵子乙醇提取物（ethanol extract of Livistona chinensis seeds，EELC）、DAPT或抗VEGF抗體處理下，分別采用MTT、Western blot、ELISA和劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，檢測Notch和VEGF通路相關(guān)的分子表達(dá)，以此探究蒲葵子對Bel-7402細(xì)胞增殖和遷移能力的影響和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株Bel-7402購于美國ATCC細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，蒲葵子購于西南偏冷草藥房，人VEGF ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，HRP-標(biāo)記的山羊抗鼠二抗和HRP-標(biāo)記的山羊抗兔二抗購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，鼠抗人NICD抗體、兔抗人VEGF抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，兔抗人MMP-2抗體和兔抗人β-actin為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，DAPT、MTT及DMSO為美國Sigma公司產(chǎn)品，胰酶為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1溶液配制將蒲葵子分別用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，分別合并提取液，濃縮，冷凍干燥，備用。取一定量的EELC干粉，用DMSO和無水乙醇等體積溶解，配制600 g/L EELC儲液，無菌過濾。用DMSO配制20 mmol/L DAPT儲液。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組Bel-7402細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以下各實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均分為5組，對照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、150μg/ml EELC處理組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+EELC）、300μg/ml EELC處理組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+EELC）、10μmol/L DAPT處理組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+DAPT）和10μg/ml抗VEGF抗體處理組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+抗VEGF抗體），各組細(xì)胞用相應(yīng)處理的培養(yǎng)基孵育時間一致。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖活性將Bel-7402細(xì)胞按1×104個/孔的密度接種于96孔板，每孔200μl培養(yǎng)基，24h后換液，并按24h和48h時間點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞，各自分5組，分別加180μl相應(yīng)處理的含血清培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔。分別在24和48 h時間點(diǎn)，收集上清液，同時向待測孔加入20μl MTT溶液（5 g/L），37℃，4 h。棄上清液，每孔加入150μl DMSO，溶解后，酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔的吸光值（OD值），并按公式計算各組的細(xì)胞活性：細(xì)胞相對活性=處理組平均OD值/對照組平均OD值× 100%。

1.2.4Western blot檢測Notch-VEGF途徑相關(guān)蛋白表達(dá)將Bel-7402細(xì)胞按4×105個/孔的密度接種于6孔板，24 h后換液，進(jìn)行無血清RPMI 1640培養(yǎng)24 h之后，向各組中分別加相應(yīng)處理的無血清培養(yǎng)基。作用24 h后，提取細(xì)胞全蛋白，Western blot法檢測VEGF、MMP-2、NICD等蛋白的表達(dá)。

1.2.5ELISA檢測細(xì)胞VEGF分泌水平按1.2.3方法獲取相應(yīng)處理后的上清液，置于4℃冰箱保存，10 000 r/min，離心10 min，收集上清液，用BCA法檢測蛋白的濃度。另取各組部分上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，最后酶標(biāo)儀檢測，讀取450 nm處的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組細(xì)胞分泌上清液中每1 mg蛋白中的VEGF含量。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力將Bel-7402細(xì)胞按4×105個/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞長至80%左右匯合時換液，進(jìn)行無血清RPMI 1640培養(yǎng)24 h。然后用200μl無菌槍頭在單層細(xì)胞上劃

痕，PBS洗去漂浮細(xì)胞，后向各組中分別加相應(yīng)處理的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。在劃痕后0、24 h時間點(diǎn)，均通過倒置顯微鏡和電腦軟件在同一位置觀察劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移情況，并計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同處理對BeI-7402細(xì)胞增殖情況的影響

MTT結(jié)果顯示，在24和48 h時間點(diǎn)，與對照組比較，EELC、DAPT和抗VEGF抗體組的細(xì)胞增殖均受到了不同程度的抑制（P＜0.05），而且隨著作用時間的延長，抑制效果更加明顯。同時，EELC對該細(xì)胞增殖的抑制作用隨劑量的增加而增強(qiáng)，300μg/ml、48 h EELC處理對Bel-7402細(xì)胞有極其顯著的增殖抑制作用，細(xì)胞相對活性低至31%。見圖1。

圖1 不同處理對BeI-7402細(xì)胞增殖的影響

2.2不同處理對BeI-7402細(xì)胞Notch-VEGF途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，EELC、DAPT和抗VEGF抗體組的細(xì)胞VEGF、MMP-2、 NICD等蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)（P＜0.05），并且高濃度的EELC比低濃度的EELC對3種蛋白表達(dá)的下調(diào)作用更顯著，有著明顯的濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系。見圖2。

圖2 不同處理對BeI-7402細(xì)胞VEGF、MMP-2、NICD蛋白表達(dá)水平的影響

2.3不同處理對BeI-7402細(xì)胞分泌VEGF水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，見圖3，在24和48 h時間點(diǎn)，EELC、DAPT和抗VEGF抗體等處理均能不同程度地降低Bel-7402細(xì)胞分泌VEGF水平，與同樣時間條件下的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而且，EELC濃度越高，相應(yīng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF含量越低。此外，隨著作用時間的延長，各組

細(xì)胞的VEGF分泌量反而略有下降。

2.4不同處理對BeI-7402細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕24 h后，各組細(xì)胞均有不同數(shù)量的遷移，但對照組的細(xì)胞遷移現(xiàn)象最為明顯，各處理組的細(xì)胞發(fā)生遷移的數(shù)目明顯低于對照組（P＜0.05）。EELC、DAPT和抗VEGF抗體等處理對Bel-7402細(xì)胞的遷移能力都是有所抑制，并且該細(xì)胞的遷移能力與EELC濃度呈負(fù)相關(guān)。見圖4。

圖4 不同處理對BeI-7402細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是肝癌患者死亡的的首要原因，也是臨床治療易復(fù)發(fā)，預(yù)后差的主要原因[8]。在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中，肝癌細(xì)胞中的VEGF、MMP-2和NICD蛋白表達(dá)量相比于正常細(xì)胞均顯著上調(diào)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其中，VEGF是作用最強(qiáng)的血管生成因子，與肝癌細(xì)胞的遷移有關(guān)，可通過旁分泌途徑誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤生長；也可作為一種自分泌生長調(diào)節(jié)因子而直接刺激腫瘤生長。同時它還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2等降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，從而有利于肝癌細(xì)胞遷移進(jìn)入脈管系統(tǒng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成。因此，VEGF幾乎參與整個血管新生的病理生理過程。而NICD是Notch信號通路激活后，細(xì)胞表面的Notch受體與配體結(jié)合，在γ-分泌酶的水解作用下，Notch受體的胞內(nèi)段被切割而形成的片段產(chǎn)物，隨后該片段進(jìn)入細(xì)胞核，作用于下游基因，從而產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)?？傊琕EGF通路與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、血管形成以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)；Notch通路則是結(jié)構(gòu)高度保守的經(jīng)典信號通路，參與生物個體發(fā)育和腫瘤不同發(fā)生發(fā)展的過程。

該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EELC作用能明顯抑制Bel-7402

細(xì)胞的增殖和遷移水平，有一定的濃度依賴性和時間依賴性，說明蒲葵子在調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有一定的抑制作用。抑制Notch或者VEGF通路也均使Bel-7402細(xì)胞的增殖作用和遷移水平明顯降低，說明在抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移方面，蒲葵子、Notch抑制劑DAPT和抗VEGF抗體3者是有相同的抑制作用。另外，在EELC、DAPT和抗VEGF抗體分別作用下，Bel-7402細(xì)胞的VEGF分泌水平都明顯降低，提示蒲葵子的抗腫瘤機(jī)制可能通過降低細(xì)胞分泌VEGF，而抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體表達(dá)，從而干預(yù)VEGF和Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實(shí)現(xiàn)。

本研究表明，蒲葵子可通過下調(diào)Notch通路來抑制肝癌轉(zhuǎn)移的血管生成[4]；VEGF通路抑制劑能明顯抑制VEGF引發(fā)的主動脈環(huán)微血管形成和植入的人工基底膜新血管形成[9]；在Notch信號上調(diào)的腫瘤發(fā)生中，抑制Notch通路可能加強(qiáng)VEGF抑制劑作用[10]；同時抑制Notch和VEGF通路并不影響腫瘤重量，但會導(dǎo)致血管退化，降低腫瘤活性，遠(yuǎn)高于單獨(dú)抑制某一通路的效果[7]?？梢奛otch和VEGF通路在促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤血管形成上是有共同之處的，并且蒲葵子很可能是通過Notch-VEGF途徑來實(shí)現(xiàn)對肝癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制。

本研究表明，抑制肝癌細(xì)胞Notch通路會導(dǎo)致VEGF表達(dá)下調(diào)[11]，VEGF的表達(dá)也可影響Notch通路[12]，可見Notch和VEGF信號通路是相互作用、相互調(diào)節(jié)的作用方式。而抗VEGF抗體可以中和VEGF的作用，抑制其與受體結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長；Notch抑制劑DAPT則可下調(diào)Notch通路。本實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度EELC、DAPT或者抗VEGF抗體分別與Bel-7402細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，檢測到NICD、MMP-2和VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，即Notch和VEGF通路均明顯受到抑制，進(jìn)一步證實(shí)Notch和VEGF通路主要是通過相互作用來調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并且蒲葵子作用于Bel-7402細(xì)胞，可通過下調(diào)Notch和VEGF通路，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的的增殖和遷移。

綜上所述，Bel-7402細(xì)胞中的Notch-VEGF信號通路處于激活狀態(tài)。其中VEGF、MMP-2和NICD等分子均為高表達(dá)，VEGF分泌量、細(xì)胞增殖和遷移能力也均處于較高水平。而蒲葵子可通過Notch-VEGF途徑能明顯抑制VEGF、MMP-2和NICD等相關(guān)分子表達(dá)，并使人肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖和遷移能力明顯降低，且表現(xiàn)為一定的濃度依賴性和時間依賴性。因此，蒲葵子作用可顯著降低肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，抑制血管形成和肝癌轉(zhuǎn)移，這無疑為今后蒲葵子應(yīng)用于肝癌靶向藥物的開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也可能為肝癌治療提供一條新途徑。

[1]HUANG WC,HSU RM,CHI LM,et al.Selective downregulation of EGF receptor and downstream MAPK pathway in human cancer cell lines by active components partially purified from the seeds of Livistona chinensis R.Brown[J].Cancer Lett,2007,248(1): 137-146.

[2]SARTIPPOUR MR,LIU C,SHAO ZM,et al.Livistona extract inhibits angiogenesis and cancer growth[J].Oncol Rep,2001,8(6): 1355-1357.

[3]王慧,李傲,董小萍,等.蒲葵子抗腫瘤活性部位篩選及抗血管生成作用[J].中藥材,2008,31(5):718-722.

[4]LIN W,ZHAO J,CAO Z,et al.Livistona chinensis seeds inhibit hepatocellular carcinoma angiogenesis in vivo via suppression of the Notch pathway[J].Oncol Rep,2014,31(4):1723-1728. [5]HERNANDEZ-GEA V,TOFFANIN S,FRIEDMAN SL,et al. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,2013,144(3): 512-527.

[6]THURSTON G,KITAJEWSKI J.VEGF and Delta-Notch:interacting signalling pathways in tumour angiogenesis[J].Br J Cancer, 2008,99(8):1204-1209.

[7]HERNANDEZ SL,BANERJEE D,GARCIA A,et al.Notch and VEGF pathways play distinct but complementary roles in tumor angiogenesis[J].Vasc Cell,2013,5(1):17.

[8]TSUJIMOTO M,AOZASA K,NAKAJIMA Y,et al.Hepatocellular carcinoma with sarcomatous proliferation showing an unusual and wide-spread metastasis[J].Pathol Int,2011,34(4):839-845.

[9]HUANG SW,LIEN JC,KUO SC,et al.Antiangiogenic mechanisms of PJ-8,a novel inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor signaling[J].Carcinogenesis,2012,33(5):1022-1030.

[10]LI JL,SAINSON RC,OON CE,et al.DLL4-Notch signaling mediates tumor resistance to anti-VEGF therapy invivo[J]. Cancer Res,2011,71(18):6073-6083.

[11]ZHOU L,WANG DS,LI QJ,et al.Downregulation of the Notch signaling pathway inhibits hepatocellular carcinoma cell invasion by inactivation of matrix metalloproteinase-2 and-9 and vascular endothelial growth factor[J].Oncol Rep,2012,28(3): 874-882.

[12]MASUMURA T,YAMAMOTO K,SHIMIZU N,et al.Shear stress increases expression of the arterial endothelial marker ephrinB2 in murine ES cells via the VEGF-Notch signaling pathways[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(12):2125-2131.

（劉東京 編輯）

Effects of Livistona chinensis seeds on proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells

Jun－bin LIU1,Wei－h(huán)ong WU2,Jun－h(huán)ua JIN1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,2.Outpatient Office,the Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical University,Huhhot,Inner Mongolia 010050,P.R.China)

【Objective】To study the effect of ethanol extract of Livistona chinensis seeds(EELC)on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells.【Methods】Cultured Bel－7402 cells were randomized into five groups:control group,150 μg/ml EELC group,300 μg/ml EELC group,10 μmol/L DAPT group and 10 μg/ml anti－vascular endothelial growth factor(VEGF)group.After treatment,cell proliferation was determined by MTT assay and cell migration by wound－h(huán)ealing assay.Furthermore,the expressions of VEGF,matrix metalloproteinase－2(MMP－2)and Notch intracellular domain(NICD)in Bel－7402 cells were evaluated by Western blot,and the secretion of VEGF protein was detected by ELISA.【Results】Treatments with different concentrations of DAPT,anti－VEGF antibody and EELC inhibited the proliferation and migration of Bel－7402 cells,as well as the expressions of VEGF,MMP－2 and NICD proteins(P＜0.05). Additionally,EELC inhibited cell proliferation and migration as well as gene expressions in a dose－and time－dependent manner.【Conclusion】EELC may inhibit the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel－7402 cells through Notch－VEGF pathway.

Livistona chinensis seed;Bel－7402 cell line;Notch－VEGF;proliferation;migration

R735.7

A

1005-8982（2015）24-0014-05

2015-04-14