張朝霞，崔森，張萍，王花，劉芳

（1.青海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001）

·臨床論著·

慢性高原病患者骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白的表達(dá)研究*

張朝霞1，崔森2，張萍1，王花1，劉芳1

（1.青海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001）

目的研究Bcl-w和Bid蛋白在慢性高原?。–MS）患者骨髓組織中的表達(dá)情況，探討它們?cè)贑MS發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法選取18例CMS患者為CMS組，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白的表達(dá)情況。16例單純陳舊性骨折患者為對(duì)照組。結(jié)果CMS組骨髓組織中Bcl-w及Bid蛋白陽性表達(dá)率分別為77.78%及11.11%，對(duì)照組骨髓組織中Bcl-w及Bid蛋白陽性表達(dá)率分別為31.25%及50.00%，CMS組骨髓組織中Bcl-w蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；而CMS組骨髓組織中Bid蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。CMS組Bcl-w、Bid陽性系數(shù)分別為（4.15±2.11）及（0.33±0.18），對(duì)照組Bcl-w、Bid陽性系數(shù)分別為（0.87±0.43）及（0.93±0.51），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CMS組Bcl-w蛋白表達(dá)陽性系數(shù)與血紅蛋白濃度呈正相關(guān)（r=0.835，P＜0.05），而Bid蛋白陽性系數(shù)與血紅蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.659，P＜0.05）。結(jié)論CMS患者骨髓組織抗凋亡蛋白Bcl-w表達(dá)增高，促凋亡蛋白Bid表達(dá)降低，Bcl-w和Bid蛋白表達(dá)變化與CMS骨髓紅細(xì)胞凋亡異常有關(guān)。

慢性高原病；Bcl-w；Bid；細(xì)胞凋亡

慢性高原病（chronic mountain sickness，CMS）是生活于2 500米以上地區(qū)的世居和長期移居居民，對(duì)高原低氧環(huán)境逐漸失去習(xí)服而發(fā)生的臨床綜合征，又稱Monge病，曾稱高原紅細(xì)胞增多癥（high altitude polycythemia，HAPC），以過度紅細(xì)胞積累和嚴(yán)重低氧血癥為特征[1]。CMS的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，既往研究肯定了紅細(xì)胞增殖在CMS發(fā)病中的作用，但對(duì)細(xì)胞凋亡方面的研究非常有限，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖一樣，在機(jī)體中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，可能在CMS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近期對(duì)其骨髓細(xì)胞凋亡的研究受到高度關(guān)注，發(fā)現(xiàn)CMS患者骨髓造血細(xì)胞凋亡減少[2-3]，而且CMS骨髓細(xì)胞凋亡減少的分子機(jī)制可能涉及到Fas/FasL、TNF/TNFR信號(hào)系統(tǒng)以外的其他凋亡分子和途徑[4]。Bcl-2家族中家族中的Bcl-w和Bid蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，與線粒體依賴的細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CMS患者骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白表達(dá)水平變化，探討他們?cè)贑MS發(fā)生、發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

18例男性CMS患者（CMS組），年齡（42.8±11.5）歲，均長期居住在海拔2 800～4 500米地區(qū)。CMS組患者血紅蛋白（HGB）濃度（235.6±16.4）g/L，符合第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)《慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)》確診[1]。對(duì)照組選取同海拔地區(qū)16例單純陳舊性骨折患者，年齡（43.5±11.1）歲，均為男性，研究對(duì)象均排除各種急、慢性感染及原發(fā)性心、肺、肝、腎疾患。本研究經(jīng)過青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，并取得研究對(duì)象的知情同意。兩組間年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2標(biāo)本采集及處理

采集空腹靜脈血2 ml注入含有EDTA的試管中充分混勻，行血細(xì)胞學(xué)分析。行骨髓活檢術(shù)取骨髓組織，標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)骨髓組織Bcl-w和Bid蛋白，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.4BcI-w和Bid染色結(jié)果判定

所有染色切片均由3人計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，每份樣本用雙盲法閱片2次，取平均值。Bcl-w和Bid蛋白主要存在于細(xì)胞漿，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。為精確判斷蛋白的表達(dá)程度及減少假陽性率，記分標(biāo)準(zhǔn)參照許良中等[5]的方法，根據(jù)細(xì)胞漿的著色程度及著色細(xì)胞的百分率進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算陽性系數(shù)（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1）。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘，即為陽性系數(shù)。陰性是指陽性系數(shù)為0、1分者，2、3分為（+），4～6分為（++），如為9分為（+++）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，兩指標(biāo)間相關(guān)性分析用直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 免疫組織化學(xué)染色記分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1CMS組及對(duì)照組Bid和BcI-w的表達(dá)

CMS組和對(duì)照組骨髓組織中Bcl-w和Bid蛋白表達(dá)情況見表2～4。CMS組Bcl-w蛋白表達(dá)陽性率和陽性系數(shù)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；CMS組Bid蛋白表達(dá)陽性率和陽性系數(shù)分別低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3、4）。CMS組及對(duì)照組Bcl-w和Bid蛋白表達(dá)見圖1。

2.2BcI-w和Bid蛋白表達(dá)與血紅蛋白（Hb）之間的相關(guān)性

CMS組中，Bcl-w蛋白表達(dá)陽性系數(shù)與Hb濃度間呈顯著正相關(guān)（r=0.835，P＜0.05），見圖2；Bid蛋白表達(dá)陽性系數(shù)與Hb濃度間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.659，

P＜0.05），見圖3所示；Bcl-w與Bid蛋白陽性系數(shù)間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白的表達(dá)情況例（%）

表3 骨髓組織中BcI-w和Bid蛋白陽性表達(dá)情況

表4 骨髓組織中Bid和BcI-w蛋白表達(dá)陽性系數(shù)

圖1 BcI-w和Bid蛋白在骨髓組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)SP法DAB染色標(biāo)尺示50μm）

圖3 CMS組Bid與Hb關(guān)系散點(diǎn)圖

3 討論

CMS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，人們從紅細(xì)胞生物學(xué)特性、種族差異性、基因[6]、VEGF[7]、端粒酶等不同角度多方面研究高原適應(yīng)及CMS的發(fā)病機(jī)制。CMS的根本原因是高原低氧，大量研究證明低氧可造成線粒體損傷，線粒體跨膜電位破壞，離子流動(dòng)變化，而致呼吸鏈破壞，更重要的是釋放凋亡相關(guān)的分子如Smac/ DIABLO、HtrA2/Omi和細(xì)胞色素C等而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。從理論上說，低氧可誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但對(duì)于CMS來說，骨髓細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制更為復(fù)雜。近幾年對(duì)CMS發(fā)病機(jī)制的研究顯示，CMS患者有核紅細(xì)胞凋亡指數(shù)下調(diào)[2-4]，其機(jī)制與Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-XL[10]、Bax、Bid[3]及Bak[11]表達(dá)異常有關(guān)。低氧誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子高表達(dá)可廣泛激活許多缺氧反應(yīng)基因（HRGs），眾多的HRGs傳導(dǎo)細(xì)胞增殖信號(hào)，促進(jìn)紅細(xì)胞增殖的同時(shí)也傳導(dǎo)抗凋亡信號(hào)而抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-w主要分布于線粒體膜上，維持線粒體膜穩(wěn)定性，阻止線粒體釋放凋亡相關(guān)分子而發(fā)揮抗凋亡作用[12]，與細(xì)胞色素C線粒體途徑的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。而造血干細(xì)胞因子可上調(diào)Bcl-w，通過對(duì)抗細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)造血細(xì)胞的正調(diào)節(jié)作

用。線粒體途徑可以通過利用caspases與促凋亡蛋白之間的相互作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[13]。激活的caspase-8能使胞質(zhì)中的Bid斷裂成tBid，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體上，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)人胞質(zhì)，從而把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，有效地?cái)U(kuò)大了凋亡信號(hào)?；罨腂id蛋白可通過與Bcl-2、Bcl-XL及Bc1-w等結(jié)合，減弱其抑制凋亡作用而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]；活化的Bid蛋白也可與Bax、Bak等結(jié)合，使Bax、Bak插人線粒體膜，從而誘導(dǎo)線粒體蛋白的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，CMS患者骨髓組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-w表達(dá)增高，Bid表達(dá)降低，提示線粒體途徑參與了CMS凋亡下調(diào)機(jī)制。研究結(jié)果還顯示CMS患者骨髓組織中Bcl-w表達(dá)升高且與血紅蛋白濃度間呈正相關(guān)，Bid表達(dá)降低且與血紅蛋白濃度間呈負(fù)相關(guān)，提示CMS患者骨髓紅細(xì)胞凋亡下調(diào)的機(jī)制與Bcl-w及Bid表達(dá)異常有關(guān)，由此引起的骨髓造血細(xì)胞凋亡下調(diào)與紅細(xì)胞增殖增強(qiáng)在CMS發(fā)病中起協(xié)同促進(jìn)作用，提示線粒體途徑細(xì)胞凋亡信號(hào)變化與CMS骨髓細(xì)胞凋亡異?？赡苡兄欢ǖ年P(guān)系。今后將進(jìn)一步研究CMS骨髓造血細(xì)胞凋亡、下調(diào)及Bcl-2家族蛋白表達(dá)變化的機(jī)制，為開展CMS干預(yù)性研究提供理論依據(jù)。

[1]LEóN-VELARDE F,MAGGIORINI M,REEVES JT,et al.Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases[J]. High Alt Med Biol,2005,6(2):147-157.

[2]鄒成林,崔森,冀林華,等.慢性高原病骨髓細(xì)胞環(huán)氧化酶2和熱休克蛋白70表達(dá)及細(xì)胞凋亡研究[J].廣東醫(yī)學(xué),2010,31(11): 1409-1412.

[3]陳楊楊,崔森,李占全,等.慢性高原病患者骨髓有核紅細(xì)胞凋亡及Bcl-xl,Bax,Bid表達(dá)水平研究[J].中華血液學(xué)雜志,2012,33(4): 326-328.

[4]崔森,許存和,賈乃鏞,等.慢性高原病及高原低氧條件下機(jī)體骨髓細(xì)胞凋亡異常及干預(yù)研究[J].高原醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(3):32.

[5]許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國癌癥雜志,1996,16(4):229-231.

[6]BUROKER NE,NING XH,ZHOU ZN,et al.Genetic associations with mountain sickness in Han and Tibetan residents at the Qinghai-Tibetan Plateau[J].Clin Chim Acta.2010,411(19): 1466-1473.

[7]BROCKINGTON A,HEATH PR,HOLDEN H,et al.Downregulation of genes with a function in axon outgrowth and synapse formation in moror neurons of the VEGF delta/delta mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J].BMC Genomics,2010,11(3): 1471-2164.

[8]REEVE JL,SZEGEZDI E,LOGUE SE,et al.Distinct mechanisms of cardiomyocyte apoptosis induced by doxorubicin and hypoxia converge on mitochondria and are inhibited by Bcl-xl[J]. J Cell Mol Med,2007,11(3):509-520.

[9]LEE SD,KUO WW,LIN JA,et al.Effects of long-term intermittent hypoxia on mitochondrial and Fas death receptor dependent apoptotic pathways in rat hearts[J].Int J Cardiol,2007,116(3): 348-356.

[10]張朝霞,崔森,冀林華,等.慢性高原病患者骨髓組織Bcl-2, Bcl-XL蛋白表達(dá)水平研究[J].山東醫(yī)藥,2012,5(21):11-13.

[11]賈煒,李占全,崔森,等.慢性高原病患者骨髓組織Bak和Bax蛋白的表達(dá)水平研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(18):3071-3074.

[12]KUWANA T,MACKEY MR,PERKINS G,et al.Bid,bax and lipids cooperate to for supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane[J].Cell,2002,111(3):331-342.

[13]李莉,古正濤,劉志峰,等.Caspase-3在熱打擊誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(6):871-874.

[14]LOU X,BUDIHARDJO I,ZOU H,et al.Bid,a Bcl-2 interacting protein,mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation f cell surface death receptors[J].Cell, 1998,94(4):481-490.

[15]WEI MC,LINDSTEN T,MOOTHA VK,et al.tBID,a membrane-targeteddeath ligand,oligomerizes BAK to release cytochrome[J].Denes Dev,2000,14(16):2060-2071.

[16]LI HL,ZHU H,XU CJ,et al.Cleavage of BID by caspase-8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis[J].Cell,1998,94(4):491-501.

（劉東京 編輯）

Expressions of Bcl-w and Bid proteins in bone marrow of patients with chronic mountain sickness*

ZHao－xia ZHANG1,Sen CUI2,Ping ZHANG1,Hua WANG1,Fang LIU1
(1.Department of Clinical Medicine,Health Professional Technological College of Qinghai, Xining,Qinghai 810000,P.R.China;2.Department of Hematological,the Affiliated Hospital,Qinghai University,Xining,Qinghai 810001,P.R.China)

【Objective】To study the expressions of Bcl－w and Bid in bone marrow tissue of patients with chronic mountain sickness(CMS),and explore their possible roles in the developing process of CMS.【Methods】The samples of bone marrow used in this study were obtained from 18 patients with CMS(CMS group)and 16 patients with old fracture(control group).The expressions of Bcl－w and Bid in the bone marrow tissues were detected using the SP immunohistochemistry technique.The results were analyzed and compared between both groups.【Results】The positive rates of Bcl－w and Bid proteins were 77.78%and 11.11% in the CMS group,and 31.25%and 50.00%in the control group,respectively.The expression of Bcl－w in the CMS patients was significantly higher than that in the controls(P＜0.05),but the expression of Bid in the control group was much higher than that in the CMS group(P＜0.05).The positive coefficient of Bcl－w protein in the CMS group was significantly higher than that in the control group[(4.15±2.11)vs(0.87±0.43),P＜0.05].The positive coefficient of Bid protein in the control group was significantly higher than that in the CMS group[(0.93±0.51)vs(0.33±0.18),P＜0.05].In the CMS group,hemoglobin(Hb)value was positively correlated with Bcl－w protein and negatively correlated with Bid protein(r=0.835,－0.659respectively,both

chronic mountain sickness;Bcl－w;Bid;apoptosis

R594

A

1005-8982（2015）24-0019-04

2015-04-20

青海省衛(wèi)生廳2012年醫(yī)藥衛(wèi)生科研指導(dǎo)性計(jì)劃課題

P＜0.05).【Conclusion】The over－expression of Bcl－w and low－expression of Bid might be involved in mechanism of the change of erythroblast apoptosis in CMS patients.