李大鵬　盧冠男　張磊　趙東海

一種查爾酮衍生物對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖及凋亡的影響

李大鵬1盧冠男1張磊2趙東海3

目的 探討查爾酮衍生物（4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮）對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞H 1 792增殖的影響。方法 體外培養(yǎng)H 1 792細(xì)胞，以不同濃度（10、20及40 μmol/L）的4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮處理細(xì)胞，作用不同時(shí)間。經(jīng)瑞氏染色進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，各劑量組的4’-甲基-2，4-羥基查爾酮均能有效抑制H 1 792肺癌細(xì)胞的增殖，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈現(xiàn)出時(shí)間濃度依賴性；用藥后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡特征，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 此查爾酮衍生物能有效抑制H 1 792肺癌細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)，為臨床非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的治療提供了研究基礎(chǔ)。

查爾酮；衍生物；H 1 792細(xì)胞；增殖；凋亡

1　材料與方法

1.1材料

使用材料為4’-甲基-2，4-羥基查爾酮（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院），四唑氮藍(lán)MTT（Sigma公司），RPMI 1 640培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），H 1 792肺癌細(xì)胞株（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），二甲基亞砜（Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H 1 792細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清血清、100 IU青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1 640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2條件下于飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，常規(guī)傳代。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 應(yīng)用不同劑量（10，20及40 μmol/L）的4’-甲基-2，4-羥基查爾酮細(xì)胞為用藥組，相同條件但不加藥物的培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組。將細(xì)胞懸液（1×104/ml）接種于96孔板，100 μl/孔，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時(shí)于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3瑞氏染色觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，藥物處理同上，培養(yǎng)24 h后，0.25%胰酶消化，800 r/min離心5 min，棄上清液，將細(xì)胞沉淀均勻涂于載玻片上，丙酮固定10 min，PBS沖洗并晾干，滴加適量瑞氏染液，靜置1 min，加等量PBS混勻，5 min后水洗、吸干，進(jìn)行鏡檢觀察。

1.2.4細(xì)胞增殖的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H 1 792細(xì)胞，0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液（1×104/ml），接種于96孔板中，加入不同劑量的4’-甲基-2，4-羥基查爾酮（10、20及40 μmol/L），以含等體積DMSO的RPMI 1 640培養(yǎng)基作空白對(duì)照，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO輕微震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm進(jìn)行檢測(cè)，每孔重復(fù)測(cè)定3次并取平均值，記錄A 490值，并求細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）＝（1-給藥孔平均A值/對(duì)照孔平均A值）×100%。

1.2.5細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 以10、20、40 μmol/L的4’-甲基-2，4-羥基查爾酮作用于H 1 792細(xì)胞6后，800 r/min離心5 min，細(xì)胞以預(yù)冷PBS重懸，800 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液懸浮細(xì)胞并加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻，室溫避光孵育15 min；800 r/min離心5 min；棄上清液，加190 μL的Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液，懸浮細(xì)胞，測(cè)定前5 min再加入5 μL PI染色；重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分率表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

倒置顯微鏡觀察以不同劑量4’-甲基-2，4-羥基查爾酮處理的細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給藥組細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)異常，其細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間隙變大，胞漿中出現(xiàn)顆粒，有部分細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮狀態(tài)。高濃度藥物處理后部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。

2.2瑞氏染色結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后，對(duì)照組細(xì)胞核質(zhì)比大，細(xì)胞核近圓形或橢圓形。而給藥組細(xì)胞出現(xiàn)以下變化：細(xì)胞變小且變圓，核質(zhì)比變小，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞核出現(xiàn)碎片，胞質(zhì)濃染。說明細(xì)胞用藥后出現(xiàn)退行性改變，呈老化狀態(tài)。

2.3細(xì)胞增殖的檢測(cè)

不同劑量的4’-甲基-2，4-羥基查爾酮（10、20及40 μmol/L）作用于細(xì)胞24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，與對(duì)照組相比，各濃度4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮對(duì)H 1 792細(xì)胞的增殖均有抑制作用，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并呈現(xiàn)劑量依賴性；且隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，增殖抑制作用加強(qiáng)，呈時(shí)效依賴性，見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)組不同藥物濃度對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1　實(shí)驗(yàn)組不同藥物濃度對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖的影響（±s）

4’-甲基-2，4-羥基 　　　　　　　 生長(zhǎng)抑制率（%）查爾酮濃度μ mol/L 　12 h 　24 h 　48 h 10 　6.33±0.86　　11.15±0.78 22.54±0.81 20 　12.34±0.75 　15.01±0.92 25.23±0.78 40 　43.11±1.45 　54.23±1.79 76.05±1.48

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

不同濃度4’-甲基-2，4-羥基查爾酮作用于H 1 792細(xì)胞后，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分率。結(jié)果顯示：藥物濃度為0、10、20及40 μmol/L時(shí)，H 1 792細(xì)胞的凋亡率分別為（0.86±0.21）%、（12.69±1.36）%、（29.43±3.56）%、（35.73±2.61）%。隨藥物濃度增高，H 1 792細(xì)胞凋亡率增高，呈劑量依賴性，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著吸煙人數(shù)的增加和大氣污染的加重，肺癌現(xiàn)已居于我國(guó)城市人口惡性腫瘤的死亡原因第一位，且其發(fā)病率仍呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。非小細(xì)胞型肺癌包括大細(xì)胞癌、腺癌和鱗癌，與小細(xì)胞癌不同的是，其癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂緩慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移也相對(duì)較晚。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%，其中約75%患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于癌癥中晚期，其5年生存率很低[5]，故開發(fā)新的抗肺癌藥物具有重要臨床意義。腫瘤細(xì)胞具有過度增殖的共性，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖是抗腫瘤藥研究的重要靶點(diǎn)。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一類藥用化合物，在植物中常與糖結(jié)合成苷類。絕大多數(shù)植物都含黃酮類化合物，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、開花結(jié)果及抗菌防病方面具有重要作用。查爾酮黃酮化合物的重要組成部分，是植物合成黃酮的前體物質(zhì)，流行病學(xué)研究及腫瘤細(xì)胞學(xué)相關(guān)研究表明，查爾酮及其衍生物具有很好的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能涉及腫瘤發(fā)生的多個(gè)環(huán)節(jié)[6]，例如抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究采用瑞士染色的方法觀察4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮作用于肺癌細(xì)胞H 1 792細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化，以MTT法檢測(cè)藥物組對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖的影響，并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，藥物處理組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)退行性改變并表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的特征。MTT結(jié)果顯示4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖具有抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明藥物組細(xì)胞凋亡率增加。本次研究結(jié)果顯示4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮能夠抑制H 1 792細(xì)胞增殖，可能機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此研究結(jié)果為4’-甲基-2，4-二羥基查爾酮作為肺癌治療新藥的前期研究提供了依據(jù)。

[1]趙樂晶，石玉，劉巍，等. 新型查爾酮類化合物的合成及其抗腫瘤活性[J]. 中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2010，20（3）：161-165.

[2]Qiu J, Feng H, Xiang H. Influence of subinhibitory concentrations of licochalcone A on the secretion of enterotoxins A and B by staphylococcus aureus[J]. FEMS Microbiol Lett, 2010，307（2）：135-141.

[3]Szliszka E, Czuba Z P, Mazur B, et al. Chalcones enhance TRAILInduced apoptosis in prostate cancer cells[J]. Internati-onal Journal of Molecular Sciences, 2009，11（1）：1-13.

[4]Xiao XY, Hao M, Yang XY. Licochalcone A inhibits growth of gastric cancer cells by arresting cell cycle progression and inducing apoptosis[J]. Elsevier, 2011，302（1）：69-75.

[5]王穎軼，陳書長(zhǎng)． STATS，VEGF和EGFR在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)研究[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（4）：826-829．

[6]Shibata S. A drug over the millennia ：pharmacognosy, chemistry and pharmacology of licorice[J]. Yakugaku Zasshi, 2000，120（10）：849-862.

The Influence of a Sort of Ramification Chalcone for H 1 792 Cell Proliferation and Apoptosis

LI Dapeng1LU Guannan1ZHANG Lei2ZHAO Donghai31 Department of Respiratory Medicine, the Affiliated Hospital of Jilin Medical College, Jilin 132013, China. 2 Laboratory Medical College, Jilin Medical College, Jilin 132013, China. 3 Department of Pathology, Jilin Medical College, Jilin 132013, China

Objective To investigate antiproliferative effects of derivatived ochalcone 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone in H 1 792 lung cancer cells. Methods Incultured H 1 792 lung cancer cells in virto , Treated cell with 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone of 10~20 and 40 μmol/L. The MTT test and swiss dyeing were performed to detect the inhibitory effect of H 1 792 cells proliferation. Results Compared with control group, the antiproliferation of H 1 792 cells in different doses of 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone groups were increased, P＜0.05, was difference had statisticaly significance, and presented time concentration dependence. After treatment, the cell morphology was characterized by apoptosis, and the apoptosis rate was increased, P＜0.05, was difference had statistically significance, with the increase of drug concentration. Conclusion The derivatived ochalcone can inhibit the growth of H 1 792 lung cancer cells, and its mechanism may by related to apoptosis. These results provide a research foundation for clinical treatment of non small cell lung cancer cells.

Chalcone, Derivant, H 1 792 cells, Proliferation, Apoptosis

R33

A

1674-9308（2015）31-0029-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.31.020

1 132013吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2 132013吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院；3 132013吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

查爾酮類化合物為廣泛存在于天然藥用植物（如紅花、甘草等）中的一類黃酮類化合物，其分子式為C15H12O，中文名稱為1，3-二苯基-2-丙烯-1-酮或2-苯亞甲基苯乙酮。查爾酮及其衍生物可在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下由苯甲醛和苯乙酮在堿性條件下縮合生成，且為黃酮化學(xué)合成的重要中間體[1]。查爾酮及其衍生物中含有的α，β-烯酮結(jié)構(gòu)使其分子具有較大柔性，可與不同受體結(jié)合發(fā)揮多種生物活性，如抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗?jié)?、抗瘧疾、抗菌消炎等[2]。目前，對(duì)于查爾酮類化合物的抗腫瘤活性開展了大量的相關(guān)研究[3-4]。4’-甲基-2，4-羥基查爾酮是一種新型的查爾酮衍生化合物，前期實(shí)驗(yàn)研究表明其具有抗腫瘤的作用，但目前有關(guān)其對(duì)H 1 792小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用H 1 792肺癌細(xì)胞株，觀察4’-甲基-2，4-羥基查爾酮對(duì)H 1 792細(xì)胞增殖的影響，為4’-甲基-2，4-羥基查爾酮在抗肺部腫瘤的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)參考。