劉海春 盧 帥 冉 挺 張艷敏 徐金星 熊 瀟徐安陽(yáng) 陸 濤,2,* 陳亞東,*

(1中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院, 南京 211198; 2中國(guó)藥科大學(xué), 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210009)

基于分子對(duì)接和QSAR方法預(yù)測(cè)B-Raf II型抑制劑活性

劉海春1盧 帥1冉 挺1張艷敏1徐金星1熊 瀟1徐安陽(yáng)1陸 濤1,2,*陳亞東1,*

(1中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院, 南京 211198;2中國(guó)藥科大學(xué), 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210009)

B-Raf激酶在促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用, 已被確定為癌癥治療非常有吸引力的靶標(biāo). 新型高效B-Raf抑制劑的開發(fā)成為癌癥治療的一個(gè)熱門研究領(lǐng)域. 本文以結(jié)構(gòu)多樣的B-Raf II型抑制劑為研究對(duì)象, 聯(lián)合應(yīng)用分子對(duì)接和定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型研究其定量構(gòu)效關(guān)系去探討抑制活性的起源. 兩個(gè)主題作為研究重點(diǎn): 生物活性構(gòu)象和描述符. 首先對(duì)分子對(duì)接方法(Glide、Gold、LigandFit、Cdocker和Libdock)進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)價(jià), 后將研究的對(duì)象分子對(duì)接到B-Raf活性位點(diǎn)并獲得生物活性構(gòu)象. 基于準(zhǔn)確的對(duì)接結(jié)果, 計(jì)算得到16個(gè)打分評(píng)價(jià)函數(shù)和21個(gè)能量描述符, 以此構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系模型. QSAR結(jié)果表明模型具有高度精確的擬合和強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力(模型同時(shí)探討了對(duì)抑制活性有重要影響的描述符, 結(jié)果表明打分評(píng)價(jià)函數(shù)(G_Score, -ECD, Dock_Score, PMF)與能量描述符(S(hb_ext), DE(int), Emodel)對(duì)抑制活性影響非常大. 通過(guò)虛擬篩選和QSAR模型理論預(yù)測(cè), 一些新的具有潛在抑制活性的化合物作為B-Raf II型抑制劑被獲得. 上述信息對(duì)于進(jìn)一步設(shè)計(jì)新穎高效的B-Raf II型抑制劑提供了有用的指導(dǎo).

B-Raf II型抑制劑; 分子對(duì)接; 打分評(píng)價(jià)函數(shù); 對(duì)接能量描述符; 定量構(gòu)效關(guān)系模型

1 引 言

促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖中起著重要作用.1Raf是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族, 其激活突變能夠促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與增殖, 因此與腫瘤發(fā)生密切相關(guān). Raf激酶家族有3 個(gè)亞型: A-Raf、B-Raf和C-Raf (Raf-1). 與ARaf和C-Raf相比, B-Raf有更高的激酶活性. 目前已確定B-Raf被激活后的體細(xì)胞突變率在黑色素瘤中高達(dá)50%–70%, 卵巢癌中達(dá)35%, 甲狀腺癌中達(dá)30%, 結(jié)腸癌中達(dá)10%.2最常見的B-Raf突變發(fā)生在臨近保守的DFG (Asp-Phe-Gly) 基序的600位殘基,即谷氨酸取代了纈氨酸(V600E). B-RafV600E具有癌基因的特點(diǎn), V600E突變的B-Raf的催化活性比野生型B-Raf (B-RafWT)提高了500倍.3–5

通過(guò)B-Raf激酶抑制劑與其蛋白結(jié)合的晶體復(fù)合物分析, 根據(jù)DFG序列及α-C螺旋位置的不同, BRaf激酶抑制劑可分為I型、II型和I1/2型.6目前已有4個(gè)B-Raf激酶抑制劑上市, 包括II型抑制劑Sorafenib和Regorafenib,7–10以及I1/2型抑制劑Vemurafenib和Dabrafenib11–16(圖1). 據(jù)報(bào)道I型和I1/2型抑制劑可以異常激活B-RafWT或者M(jìn)APK通路中Raf-1, 引起腫瘤的二次增長(zhǎng). 而II型抑制劑因能夠抑制多種激酶的活性, 包括Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF-β、C-KIT和Ret等, 可以逆轉(zhuǎn)這種耐藥性.17–19

圖1 已上市的B-Raf激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of the approved B-Raf kinase inhibitors

近年計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)(CADD)在新藥開發(fā)中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用, 定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)和對(duì)接(DOCK)是CADD的兩個(gè)主要工具.分子對(duì)接方法是將小分子化合物放入大分子蛋白靶標(biāo)活性口袋中, 預(yù)測(cè)小分子與靶標(biāo)的結(jié)合模式,同時(shí)應(yīng)用打分函數(shù)評(píng)估其與大分子的結(jié)合自由能.分子對(duì)接目前已相對(duì)成熟, 但絕非完美, 仍有大量的問題有待進(jìn)一步研究. 目前打分函數(shù)只能粗略評(píng)估結(jié)合自由能及預(yù)測(cè)生物活性.20–23幸運(yùn)的是, QSAR方法具有準(zhǔn)確可靠評(píng)估結(jié)合自由能, 預(yù)測(cè)新的先導(dǎo)物生物活性的能力. QSAR通過(guò)理論計(jì)算已知結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)物的物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 找出結(jié)構(gòu)與其生物效應(yīng)(如生物利用度、活性或毒性等)的定量關(guān)系, 建立結(jié)構(gòu)活性模型并以此指導(dǎo)藥物分子設(shè)計(jì). QSAR方法應(yīng)用日益廣泛, 具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度, 但也遭遇到了不少問題. 目前選擇和設(shè)計(jì)合適的描述符參數(shù)是QSAR研究的一大熱點(diǎn). 隨著計(jì)算能力的提高, 計(jì)算化學(xué)也將提供更為準(zhǔn)確的參數(shù), 為進(jìn)行準(zhǔn)確的QSAR研究奠定基礎(chǔ).24,25

為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分子結(jié)合自由能提高虛擬篩選打分排序, 本研究結(jié)合分子對(duì)接和QSAR方法的技術(shù)力量建立以對(duì)接產(chǎn)生的打分函數(shù)和能量描述子為自變量的QSAR模型. 先是分子對(duì)接準(zhǔn)確性評(píng)價(jià), 對(duì)Glide、Gold、Cdocker、LigandFit和Libdock26–28對(duì)接策略進(jìn)行可靠性驗(yàn)證. 在準(zhǔn)確的對(duì)接基礎(chǔ)上, 對(duì)結(jié)構(gòu)多樣的B-Raf II型抑制劑進(jìn)行對(duì)接建立正確的結(jié)合模式, 產(chǎn)生分子對(duì)接評(píng)價(jià)參數(shù), 包括16個(gè)打分評(píng)價(jià)函數(shù)和21個(gè)對(duì)接產(chǎn)生的能量描述符. 利用一元線性及多重線性(MLR)回歸方法對(duì)打分評(píng)價(jià)函數(shù)及能量描述符和實(shí)驗(yàn)活性之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 建立QSAR模型.29,30MLR-QSAR模型獲得了預(yù)測(cè)活性和實(shí)驗(yàn)pIC50值之間的高相關(guān)性系數(shù)并具有良好的預(yù)測(cè)能力. 應(yīng)用具有良好預(yù)測(cè)能力的MLRQSAR模型得到多個(gè)具有較好的預(yù)測(cè)活性且骨架新穎的化合物可作為潛在的B-Raf先導(dǎo)化合物. 分子對(duì)接聯(lián)合QSAR模擬方法為合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化新的具有潛在活性的B-Raf II型抑制劑提供了新的策略.

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 B-Raf晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

從RCSB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)選擇最具代表性也是最早發(fā)表的B-Raf晶體復(fù)合物(PDB ID: 1UWH, 分辨率為0.295 nm, 配體為Sorafenib)作為對(duì)接模板.3復(fù)合物結(jié)構(gòu)用Discovery Studio (DS)28進(jìn)行預(yù)處理, A鏈及其配體被選定保留為對(duì)接目的. 將Sorafenib從復(fù)合物中提取出來(lái), 除去所有水分子, 使用Sybyl31將配體和受體分別加氫加電荷進(jìn)行結(jié)構(gòu)能量最小化.

2.2 訓(xùn)練集和測(cè)試集的準(zhǔn)備

B-Raf抑制劑數(shù)據(jù)來(lái)源于Binding Database (http://www.bindingdb.org/bind/index.jsp), 收集有BRaf抑制活性的化合物, 刪除重復(fù)的I型和I1/2型結(jié)構(gòu)及IC50≥ 10 μmolL–1的化合物, 最終選擇70個(gè)具有明顯活性變化梯度(IC50最小2.5 nmolL–1, 最大8800nmolL–1)和結(jié)構(gòu)多樣性的II型化合物用于模型構(gòu)建和評(píng)價(jià). 通常數(shù)據(jù)集隨機(jī)被分為訓(xùn)練集和測(cè)試集.本文為提高QSAR模型可靠性和預(yù)測(cè)能力, 采用化學(xué)指紋圖譜相似度聚類分析方法合理劃分?jǐn)?shù)據(jù)集.32,33化學(xué)指紋圖譜聚類分析是一種將數(shù)據(jù)集劃分為小區(qū)域的集群定義劃分方法. 通過(guò)化學(xué)指紋圖譜最大不同, 一些有代表性的分子被選為簇的中心,剩余分子被分配到最近的聚類中心找到相應(yīng)的集群. 通過(guò)DS計(jì)算化學(xué)指紋圖譜, Tanimoto系數(shù)為描述符描述分子相似度, 同時(shí)考慮活性梯度選擇, 數(shù)據(jù)集被分為訓(xùn)練集38分子和測(cè)試集32分子(表中帶星號(hào)化合物). 圖2顯示劃分的訓(xùn)練集分子和測(cè)試集分子(藍(lán)色小球)在化學(xué)空間的投影, 進(jìn)一步說(shuō)明數(shù)據(jù)集劃分的合理性. 表1顯示所有化合物結(jié)構(gòu)和IC50值.

2.3 分子對(duì)接、打分函數(shù)和描述符

分子對(duì)接程序Glide、Gold、LigandFit、Cdocker和Libdock被應(yīng)用, 16個(gè)打分函數(shù)和21個(gè)對(duì)接描述符被選擇進(jìn)行QSAR研究. 16個(gè)打分函數(shù)包括LigandFit的十一個(gè)打分函數(shù)(Dock_Score、PMF、PLP1、PLP2、Jain、Ligscore-1、Ligscore-2、PMF04、Ludi1、Ludi2、Ludi3), Gold的二個(gè)打分函數(shù)(Glod_Score和Chem_Score), 以及Glide的G_Score、Cdcoker的-Cdocker Interaction Energy和Libdock的Libdockscore; 對(duì)接描述符分別來(lái)源于不同的對(duì)接打分功能, 十一個(gè)來(lái)源于G_Score, 四個(gè)來(lái)源于Gold_Score, 六個(gè)來(lái)源于Chem_Score (表2).

2.3.1 Glide對(duì)接

Glide是近似為完全系統(tǒng)搜索配體的構(gòu)象、取向和空間位置的對(duì)接軟件. Glide對(duì)接過(guò)程中, 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是剛性的, 而小分子的構(gòu)象是柔性的. 蛋白準(zhǔn)備模塊Protein Preparation Wizard在OPLS-2005分子力場(chǎng)下準(zhǔn)備受體; 以晶體復(fù)合物中的配體位置為對(duì)接中心, Receptor Grid Generation生成格點(diǎn)文件; Ligpre準(zhǔn)備配體及其抑制劑. Ligand Docking進(jìn)行分子對(duì)接, 選擇標(biāo)準(zhǔn)精度(SP)柔性對(duì)接, 每個(gè)配體保留10個(gè)構(gòu)象, 其它參數(shù)保持默認(rèn)值. 選取打分最優(yōu)的構(gòu)象用于進(jìn)一步研究, G_Score和十一個(gè)對(duì)接描述符被獲得.

表1 B-Raf抑制劑的訓(xùn)練集和測(cè)試集分子結(jié)構(gòu), 實(shí)驗(yàn)活性值與QSAR模型(模型M1及M2)預(yù)測(cè)活性值(Pre.)及殘差(Res.)Table1 Molecular structures, actual activities vs predicted activities (Pre.) and residuals (Res.) of QSAR models (M1 and M2) for the training set and the test set of B-Raf inhibitors

*compounds in the test set

2.3.2 Gold對(duì)接

Gold (Genetic Optimisat ion for Ligand Docking)程序是應(yīng)用遺傳算法在局部柔性蛋白中尋找柔性配體構(gòu)象的自動(dòng)柔性對(duì)接程序. 可以充分搜索構(gòu)象空間, 找到相互作用的最優(yōu)模式. 本文采用Gold_ Score和Chem_Score打分函數(shù)得到分子相互作用的擬合度得分(Fitness score, 函數(shù)值大小用來(lái)判斷分子對(duì)接情況的好壞, 函數(shù)值越大則分子間相互作用越強(qiáng), 形成的包合物能量越低, 越穩(wěn)定)數(shù)值, 同時(shí)計(jì)算得到多種對(duì)接能量描述符. 結(jié)合位點(diǎn)用共結(jié)晶配體坐標(biāo)位置來(lái)定義. 各參數(shù)保持缺省值, 每個(gè)配體保留10個(gè)構(gòu)象.

表2 分子對(duì)接方法, 打分評(píng)分函數(shù)及生成的各種描述符Table2 Molecular docking methods, scoring functions, and the various descriptors used for generating models

2.3.3 Cdocker對(duì)接

Cdocker是基于CHARMm力場(chǎng)的柔性對(duì)接程序, 設(shè)定蛋白質(zhì)構(gòu)象保持不變, 配體構(gòu)象發(fā)生改變,計(jì)算配體分子和受體之間的非鍵相互作用, 以-Cdocker Interaction Energy(-ECD)表示受體和配體間結(jié)合自由能. 分子對(duì)接選取PDB晶體結(jié)構(gòu)1UWH為受體模型, 通過(guò)加氫及CHARMm力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化. 以配體原子來(lái)定義結(jié)合位點(diǎn), 其范圍半徑都采用自動(dòng)生成值, 將配體分子置入結(jié)合位點(diǎn)球中, 變更配體構(gòu)象, 進(jìn)行多構(gòu)象分子對(duì)接. 將這些不同構(gòu)象的配體分子與蛋白質(zhì)視為一個(gè)整體復(fù)合物,采用CHARMm力場(chǎng)和退火模擬算法分別優(yōu)化這些復(fù)合物的能量. 每個(gè)化合物對(duì)接后都得到10個(gè)構(gòu)象,綜合考慮其能量打分值(-ECD)及結(jié)合狀態(tài)選取最優(yōu)構(gòu)象進(jìn)行分析.

2.3.4 LigandFit 對(duì)接

LigandFit對(duì)接具備了受體分子活性位點(diǎn)的自動(dòng)尋找和確認(rèn)、構(gòu)象柔性的多配體對(duì)接以及基于力場(chǎng)的相互作用打分評(píng)價(jià)的功能. LigandFit設(shè)定活性位點(diǎn)內(nèi)關(guān)鍵的氨基酸上的基團(tuán)相互作用作為篩選標(biāo)準(zhǔn), 要求被對(duì)接的小分子發(fā)生相應(yīng)的基團(tuán)匹配,形成氫鍵, 疏水相互作用等等. 研究基于B-Raf晶體復(fù)合物中的配體Sorafenib定義對(duì)接結(jié)合位點(diǎn), 應(yīng)用蒙特卡洛算法對(duì)配體的構(gòu)象空間進(jìn)行取樣, 以基于力場(chǎng)參數(shù)的方法進(jìn)行受體和配體分子相互作用的評(píng)價(jià). 使用Ligscore對(duì)虛擬篩選結(jié)果進(jìn)一步評(píng)價(jià), 包括LigScore-1、LigScore-2、PLP1、PLP2、Jain、PMF等在內(nèi)的多種不同算法的打分函數(shù).

2.3.5 LibDock 對(duì)接

LibDock是基于特征的對(duì)接(Site Feature Docking), 在將小分子放入到結(jié)合腔內(nèi)之前需對(duì)結(jié)合腔內(nèi)部的特征(熱點(diǎn)區(qū)域“hot spot”, 即小分子配體要滿足的化學(xué)特征)進(jìn)行計(jì)算. LibDock預(yù)先生成化合物的低能量構(gòu)象, 對(duì)接過(guò)程中不再生成新的分子構(gòu)象. LibDock有自己獨(dú)特的評(píng)分系統(tǒng), 也可以使用PLP進(jìn)行評(píng)分. 本研究以B-Raf晶體蛋白1UWH為受體, ATP結(jié)合位點(diǎn)為對(duì)接中心, 半徑為1.5 nm, 每次保留30個(gè)構(gòu)象, 配體構(gòu)象產(chǎn)生方法為best, Hotspots為100, 其他參數(shù)默認(rèn), 對(duì)接結(jié)果以Libdockscore排序.

2.4 線性回歸模型

本研究以不同的對(duì)接打分函數(shù)及對(duì)接產(chǎn)生的能量描述子作為獨(dú)立變量, 利用一元線性和多元線性回歸(MLR)算法構(gòu)建強(qiáng)大的QSAR模型. 綜合考慮對(duì)接打分函數(shù)和化合物與激酶的結(jié)合狀態(tài)選取其最優(yōu)構(gòu)象. 對(duì)化合物生物活性值與其最優(yōu)構(gòu)象對(duì)接打分函數(shù)及能量描述子先進(jìn)行一元線性回歸, 分別得到一元線性回歸方程. 同時(shí)運(yùn)用TSAR軟件34對(duì)打分函數(shù)及描述符進(jìn)行MLR分析, 選出影響化合物抗癌活性的重要獨(dú)立變量, 建立MLR模型. 一些統(tǒng)計(jì)指標(biāo), 如復(fù)相關(guān)性系數(shù)(r2)、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)值(F)、均方根誤差(S)、測(cè)試集復(fù)相關(guān)系數(shù)評(píng)估模型的質(zhì)量, 模型的擬合能力檢驗(yàn)包括復(fù)相關(guān)系數(shù)和均方根誤差, 模型的內(nèi)部預(yù)測(cè)能力驗(yàn)證采用留一交叉驗(yàn)證法的CV), 模型的外部預(yù)測(cè)能力驗(yàn)證通過(guò)系數(shù)來(lái)評(píng)估.35,36

表3 Top3對(duì)接構(gòu)象均方根偏差(RMSD)值驗(yàn)證對(duì)接可靠性Table3 Root mean square deviation (RMSD) values of Top3 configurations obtained through docking for docking reliability validated

3 結(jié)果與討論

3.1 分子對(duì)接研究

3.1.1 對(duì)接可靠性驗(yàn)證

本工作的主要目的是利用不同對(duì)接程序產(chǎn)生的評(píng)分函數(shù)及描述符產(chǎn)生基于結(jié)構(gòu)的QSAR模型,以對(duì)確定新的有效的B-Raf抑制劑起指導(dǎo)作用. 生成模型之前, 驗(yàn)證分子對(duì)接方法的可靠性是非常重要和必要的. 采用B-Raf及其配體Sorafenib復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)1UWH執(zhí)行此驗(yàn)證. 通過(guò)Glide、Gold、LigandFit、Cdocker和Libdock將配體Sorafenib還原對(duì)接到激酶結(jié)合口袋, 驗(yàn)證對(duì)接方法能否再現(xiàn)結(jié)合底物在晶體結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象. 對(duì)接后的分子構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中配體分子構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn), 排名前Top3最佳對(duì)接(相應(yīng)最高打分或最低能量)構(gòu)象進(jìn)行驗(yàn)證考慮, 一般RMSD不超過(guò)0.20nm即認(rèn)為對(duì)接還原成功. 可接受的對(duì)接結(jié)果(表3顯示RMSD在0.0292–0.2154 nm)顯示對(duì)接構(gòu)象在結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)具有相似的結(jié)合位置和方向, 與晶體構(gòu)象類似(圖3顯示Top1對(duì)接結(jié)果), 表明上述對(duì)接方法能成功在B-Raf晶體結(jié)構(gòu)中還原再現(xiàn)結(jié)合底物的構(gòu)象.

3.1.2 B-Raf II型抑制劑對(duì)接結(jié)果

70個(gè)具有生物活性B-Raf II型抑制劑分子(表1)被選擇進(jìn)行分子對(duì)接和特殊的QSAR模型研究.對(duì)所有化合物進(jìn)行幾何優(yōu)化, 用上述對(duì)接方法對(duì)接到B-Raf (PDB 1UWH)晶體結(jié)構(gòu)模板的結(jié)合位點(diǎn). 基于對(duì)接打分評(píng)價(jià)函數(shù)及同B-Raf激酶之間的相互作用確定化合物的最佳對(duì)接構(gòu)象. II型B-Raf激酶抑制劑作用模式表現(xiàn)為: (1)與DFG基序天冬氨酸(Asp)和α-C螺旋谷氨酸(Glu)形成一對(duì)關(guān)鍵性的氫鍵; (2)與鉸鏈區(qū)半胱氨酸(Cys)上的NH和羰基形成1–2個(gè)氫鍵; (3)與變構(gòu)位點(diǎn)附近的疏水口袋形成疏水作用; (4)鉸鏈區(qū)附近有一個(gè)溶劑可及區(qū)(見圖4).根據(jù)對(duì)接結(jié)果研究, 所有的化合物都能夠充分準(zhǔn)確對(duì)接, 基本滿足上述作用模式, 整體取向一致, 展示對(duì)接模型良好的質(zhì)量.

圖3 Sorafenib共晶體構(gòu)象(綠色)與Top1最佳對(duì)接構(gòu)象(其他顏色)在B-Raf活性部位疊加圖Fig.3 Superimposition of co-crystallized Sorafenib (green) and redocked Top1 conformation by multiple docking (the other colors) in the active site of B-Raf

3.2 相關(guān)模型的計(jì)算和驗(yàn)證

以Glide、Gold、LigandFit、Cdocker和Libdock對(duì)接方法計(jì)算得到的打分評(píng)價(jià)函數(shù)和能量描述子(表2)作為QSAR建模的自變量函數(shù), 抑制劑分子的–lgIC50(pIC50)作為因變量函數(shù)用來(lái)構(gòu)建對(duì)接打分函數(shù)/能量描述符和B-Raf II型抑制劑pIC50的相關(guān)性模型.

3.2.1 一元線性回歸模型

首先研究實(shí)驗(yàn)活性與單一對(duì)接打分評(píng)價(jià)函數(shù)及其能量描述子的定量構(gòu)效關(guān)系, 建立一元線性回歸模型, 計(jì)算其相關(guān)性系數(shù)r2. 結(jié)果列于表4, r2在0.002到0.622之間. 對(duì)于單一打分評(píng)價(jià)函數(shù), G_Score給出最好的相關(guān)系數(shù)(r2= 0.622), Libdockscore給最差的相關(guān)系數(shù)(r2= 0.027). -ECD、Dock_Score、LigScore-1和LigScore-2等也具有相對(duì)較好的相關(guān)性系數(shù), r2在0.50左右. 這一結(jié)果表明, QSAR模型基于柔性對(duì)接的打分函數(shù)比剛性對(duì)接打分函數(shù)更能獲得高的相關(guān)系數(shù)r2. 因?yàn)橥ㄟ^(guò)柔性對(duì)接方法可以得到更準(zhǔn)確的結(jié)合模式, 而基于正確的結(jié)合模式基礎(chǔ)上的活性預(yù)測(cè)被認(rèn)為是合理的. 進(jìn)一步說(shuō)明對(duì)接方法和蛋白質(zhì)模板的驗(yàn)證是必要的. 對(duì)于單一能量描述符, Emodel給出最好的相關(guān)系數(shù)(r2= 0.471), H(rot)給最差的相關(guān)系數(shù)(r2= 0.002). Rewards和ENERGY的r2分別為0.261和0.272, Lipo, Hbond, LE, S(vdw_int)的r2也高于0.20. 說(shuō)明對(duì)接產(chǎn)生的能量描述符也可能對(duì)估計(jì)準(zhǔn)確的活性值是有用的. 一元線性回歸模型顯示每一個(gè)獨(dú)立變量同實(shí)驗(yàn)活性之間具有一定的相關(guān)性. 然而其相關(guān)性較低,大部分相關(guān)系數(shù)r2小于0.50 (表4). 因此, 單一使用對(duì)接打分函數(shù)/能量描述符對(duì)于確定有效的抑制劑和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確的抑制活性具有明顯的局限性.

圖4 B-Raf抑制劑作用模式示意圖Fig.4 Schematic diagram of interaction patterns of B-Raf kinase inhibitor

3.2.2 多重線性回歸模型

一元線性回歸模型的結(jié)果促使我們開發(fā)新的預(yù)測(cè)模型, 因此采用TSAR軟件, 通過(guò)MLR方法對(duì)訓(xùn)練集分子對(duì)接得到的16個(gè)打分函數(shù)及21個(gè)對(duì)接描述符分別進(jìn)行特定的QSAR研究, 得到相關(guān)的回歸方程M1和M2. 對(duì)回歸方程進(jìn)行了測(cè)試和驗(yàn)證, 以評(píng)估模型的質(zhì)量. 最終得到的多元線性回歸模型與一元線性回歸模型相比, 活性相關(guān)性及預(yù)測(cè)能力大大提高. M1和M2的相應(yīng)統(tǒng)計(jì)參數(shù)如表5所示.

QSAR模型M1使用所有16個(gè)打分評(píng)價(jià)函數(shù)生成, 回歸方程:

在QSAR建模中, 訓(xùn)練集樣本直接參與模型的建立, 模型的擬合能力由相關(guān)系數(shù)(r2)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD或S)來(lái)評(píng)價(jià). r2主要體現(xiàn)模型對(duì)訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)的擬合能力, 通常認(rèn)為r2越大越接近1說(shuō)明模型的相關(guān)性越好, 擬合效果越好, QSAR模型質(zhì)量越高. S表示數(shù)據(jù)與平均數(shù)據(jù)之間差值的平均數(shù). S的大小表明數(shù)據(jù)的分散性, 同樣表示模型的擬合能力, 越接近于零說(shuō)明模型擬合效果越好. 一個(gè)模型對(duì)內(nèi)部訓(xùn)練集樣本有較好的擬合能力并不代表模型具有較好的預(yù)測(cè)能力. QSAR模型最主要目的是對(duì)未知化合物進(jìn)行活性預(yù)測(cè), 基于這個(gè)意義層面考慮, 模型的預(yù)測(cè)能力顯得比擬合能力要重要. QSAR模型的穩(wěn)健性也是必要的, 否則模型受到異常值的影響會(huì)出現(xiàn)抖動(dòng)或者模型自身會(huì)存在機(jī)會(huì)相關(guān)問題. 為檢驗(yàn)所建立QSAR模型的穩(wěn)健性和內(nèi)部預(yù)測(cè)能力, 采用“留一法”(LOO) 計(jì)算交叉驗(yàn)證(CV)系數(shù)評(píng)價(jià)模型穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)能力. 當(dāng)大于0.5時(shí), 通常認(rèn)為所建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力, 越接近于1說(shuō)明穩(wěn)定性越好, 預(yù)測(cè)能力越強(qiáng).

表4 實(shí)驗(yàn)pIC50值與評(píng)分函數(shù)及描述符一元線性回歸模型相關(guān)性系數(shù)Table4 Correlations of individual scoring function and descriptors with the experimental pIC50values

表5 QSAR模型M1和M2的相應(yīng)統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table5 QSAR modes M1, M2 and the corresponding statistics

綜合考慮模型的擬合能力、穩(wěn)健性及預(yù)測(cè)能力三個(gè)要素, Alexander Tropsha曾提出, 一個(gè)較好的QSAR模型需要滿足下面兩個(gè)條件: r2> 0.600,所得打分函數(shù)QSAR模型M1復(fù)相關(guān)系數(shù)r2、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.852和 0.790, 說(shuō)明模型具有良好的擬合、穩(wěn)健性及內(nèi)部預(yù)測(cè)能力, 此B-Raf II型抑制劑QSAR模型M1是可靠的.

21個(gè)對(duì)接產(chǎn)生的表示配體和受體之間的靜電力、范德華力、氫鍵以內(nèi)部能量相互作用的描述符也被視為獨(dú)立的變量生成QSAR模型M2, 回歸方程:

模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集中化合物的活性分別進(jìn)行預(yù)測(cè), 活性實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值以及殘差見表1, 線性關(guān)系如圖5和圖6所示. 表1顯示模型M1和M2訓(xùn)練集化合物的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值絕大部分相差都很小,說(shuō)明該模型有較強(qiáng)的擬合能力. 圖5(a)和圖6(a)所示為訓(xùn)練集實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值線性回歸關(guān)系圖, 由圖可見實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有較好的相關(guān)性, 進(jìn)一步顯示模型具有較好的擬合及內(nèi)部預(yù)測(cè)能力. 同時(shí)表1顯示模型M1和M2測(cè)試集化合物預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相差也都很小, 說(shuō)明該模型有較強(qiáng)的外部預(yù)測(cè)能力. 圖5(b)和圖6(b)所示為測(cè)試集的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值線性回歸關(guān)系圖, 得到同訓(xùn)練集一樣的結(jié)果, 說(shuō)明模型具有好的外部預(yù)測(cè)能力可用來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)新抑制劑的生物活性.

圖5 基于打分函數(shù)的QSAR模型M1實(shí)驗(yàn)活性值與預(yù)測(cè)活性值關(guān)系圖Fig.5 Actual activity vs predicted activity using QSAR model M1 based on scoring functions

圖6 基于打分函數(shù)的QSAR模型M2實(shí)驗(yàn)活性值與預(yù)測(cè)活性值關(guān)系圖Fig.6 Actual activity vs predicted activity using QSAR model M2 based on docking descriptors

3.3 模型參數(shù)解釋

模型M1包括4個(gè)獨(dú)立的自變量, X1是G_Score, X2是-ECD, X4是Dock_Score, X8是PMF. G_Score基于經(jīng)驗(yàn)的打分函數(shù), 結(jié)合配體和受體之間的庫(kù)侖和范德華相互作用能, 重點(diǎn)考慮氫鍵相互作用, 同時(shí)引入溶劑化作用. G_Score負(fù)的回歸系數(shù)表明對(duì)親和力有不利的貢獻(xiàn)(G_Score打分為負(fù)值, 越小越有利). -ECD描述配體與受體的相互作用能, 包括范德華能與靜電能量. Dock_Score是基于力場(chǎng)的打分函數(shù), 包括配體的內(nèi)能以及配體與受體的相互作用能,主要考慮靜電和立體互補(bǔ)性對(duì)于結(jié)合能的貢獻(xiàn).PMF是基于知識(shí)的打分函數(shù), 總結(jié)成對(duì)相互作用包括所有在受體-配體原子間相互作用連同金屬離子相互作用和鹵素的電極電位, 將其轉(zhuǎn)換成距離依賴性Helmholtz自由能. -ECD、Dock_Score和PMF正的回歸系數(shù)表明其與親和力正相關(guān), 對(duì)親和力有積極有利的貢獻(xiàn). 模型M2中, 三個(gè)對(duì)接能量描述符S(hb_ext)、DE(int)、Emodel對(duì)活性預(yù)測(cè)有重要意義. S(hb_ext)為蛋白質(zhì)-配體的氫鍵相互作用能, 有助于提高回歸系數(shù)與其正相關(guān), 對(duì)親和力有有利的影響. DE(int)為內(nèi)部扭轉(zhuǎn)應(yīng)變張力. Emodel是Glide對(duì)接得到的能量描述符,是對(duì)G_Score的拓展. Emodel結(jié)合了G_Score, 非鍵相互作用能和內(nèi)部應(yīng)變能. DE(int)和Emodel描述符與回歸系數(shù)負(fù)相關(guān),對(duì)親和力有負(fù)貢獻(xiàn), 數(shù)值增大導(dǎo)致親和力降低. QSAR模型M1和M2表明在QSAR研究中選擇正確有效的描述符對(duì)建立良好模型的重要性. 同時(shí)結(jié)果表明通過(guò)改變某些重要描述符的大小可增強(qiáng)抑制活性.

表6 苗頭化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)及活性預(yù)測(cè)值Table6 Chemical structures and predicted activity values of the hit compounds

3.4 新化合物的篩選與活性預(yù)測(cè)

基于MLR模型, 采用分子對(duì)接對(duì)ChemDiv數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選, 用QSAR模型進(jìn)行活性預(yù)測(cè). 應(yīng)用Lipinski五規(guī)則進(jìn)行初始過(guò)濾以減少數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本數(shù)量. 首先使用一元線性回歸得到最高相關(guān)系數(shù)的Glide進(jìn)行對(duì)接虛擬篩選, 打分評(píng)價(jià)函數(shù)G_Score大于10.0且符合II抑制劑結(jié)合模式的化合物被選擇進(jìn)行深入研究. 對(duì)這些化合物進(jìn)一步進(jìn)行Gold, Cdocker、LigandFit、LibDock對(duì)接, 以得到其他打分評(píng)價(jià)函數(shù)和能量描述子進(jìn)行QSAR模型活性預(yù)測(cè).應(yīng)用MLR-QSAR模型預(yù)測(cè)進(jìn)行活性預(yù)測(cè), 最終8個(gè)具有較好的預(yù)測(cè)pIC50值(pIC50> 6.5)且骨架新穎的化合物被選擇作為潛在的先導(dǎo)化合物. 8個(gè)命中的苗頭化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)pIC50值列于表6, 仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)和評(píng)價(jià).

4 結(jié) 論

研究以定量構(gòu)效關(guān)系和分子對(duì)接方法來(lái)預(yù)測(cè)B-Raf II型抑制劑的活性. 通過(guò)對(duì)接還原配體結(jié)晶構(gòu)象驗(yàn)證分子對(duì)接方法(Glide、Gold、LigandFit、Cdocker和Libdock)的準(zhǔn)確性. 結(jié)果表明, 對(duì)接方法可以預(yù)測(cè)正確的結(jié)合模式, 對(duì)接研究對(duì)象分子到BRaf的活性位點(diǎn)同樣可以獲得生物活性構(gòu)象. 基于正確的結(jié)合模式, 計(jì)算得到對(duì)接打分函數(shù)及其能量相關(guān)的描述符. 利用一元線性及其多重線性回歸方法對(duì)打分函數(shù)及能量描述符和實(shí)驗(yàn)活性之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 找出結(jié)構(gòu)與活性的定量關(guān)系, 建立QSAR模型. 一元線性模型顯示描述符與實(shí)驗(yàn)活性的相關(guān)性較低. MLR-QSAR模型獲得了高相關(guān)性系數(shù)及良好的內(nèi)外部預(yù)測(cè)能力, 同時(shí)探討了對(duì)抑制活性有重要影響的描述符. 應(yīng)用MLR-QSAR模型的8個(gè)具有較好的預(yù)測(cè)活性且骨架新穎的化合物被選擇作為潛在的先導(dǎo)化合物, 對(duì)于進(jìn)一步設(shè)計(jì)新穎高效的B-Raf II型抑制劑提供了有用的指導(dǎo). 分子對(duì)接聯(lián)合QSAR模擬方法為合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化新的具有潛在活性的B-Raf II型抑制劑提供了新的策略. 該策略是一種很有前途的方法, 可用于新靶標(biāo)的分子設(shè)計(jì).

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Accurate Activity Predictions of B-Raf Type II Inhibitors via Molecular Docking and QSAR Methods

LIU Hai-Chun1LU Shuai1RAN Ting1ZHANG Yan-Min1XU Jin-Xing1XIONG Xiao1XU An-Yang1LU Tao1,2,*CHEN Ya-Dong1,*
(1School of Basic Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, P. R. China;2State Key Laboratory of Natural Medcines, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, P. R. China)

B-Raf kinase plays an important role in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling transmission pathway and has been identified as an attractive target for cancer therapy. The exploitation of novel and efficient B-Raf inhibitors has become a hot research topic. In this study, we investigated quantitative structure–activity relationship (QSAR) to probe the origins of the inhibitory activities of B-Raf Type II inhibitors. We used structurally diverse B-Raf Type II inhibitors and an integrated docking and QSAR extended method. We focused mainly on two themes: bioactive conformations and descriptors. First, various molecular docking methods (Glide, Gold, LigandFit, Cdocker, and Libdock) were evaluated, and then all molecules were docked into the B-Raf active site to obtain the bioactive conformations. Secondly, based on the docking results, 16 scoring functions and 21 docking-generated energy-based descriptors were calculated to construct regressionmodels. The results gave highly accurate fitting and had strong predictive abilitiesThe important descriptors were also explored to elucidate the main factors influencing the inhibition activities. The models suggested that the scoring functions (G_Score, -ECD, Dock_Score, and PMF) and docking-generated energy-based descriptors (S(hb_ext), DE(int), and Emodel) were significant. Some new compounds that are potential B-Raf inhibitors were obtained through virtual screening and theoretical predictions using the established models. Such information is useful in guiding the design of novel and robust B-Raf Type II inhibitors.

B-Raf Type II inhibitor; Molecular docking; Scoring function; Docking-generated energybased descriptor; Quantitative structure–activity relationship model

O641

10.3866/PKU.WHXB201510134

Received: July 9, 2015; Revised: October 12, 2015; Published on Web: October 13, 2015.

*Corresponding authors. LU Tao, Email: lutao@cpu.edu.cn; Tel: +86-25-86185179. CHEN Ya-Dong, Email: ydchen@cpu.edu.cn; Tel: +86-25-86185163.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (21102181, 81302634).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21102181, 81302634)資助項(xiàng)目

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