鄭 鍇，張雲(yún)喬，許會靜，方 芳，楊紫嫣，鄭 巖，董校汝，李榮霞，郝 峰

（吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林 吉林 132013）

氯離子敏感的YFP-H 148Q/V163S在FRT細(xì)胞中的表達(dá)及其應(yīng)用研究

鄭 鍇，張雲(yún)喬，許會靜，方 芳，楊紫嫣，鄭 巖，董校汝，李榮霞，郝 峰

（吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林 吉林 132013）

運用點突變試劑盒構(gòu)建pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)YFP-H148Q/V163S轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Ano1的FRT細(xì)胞，熒光淬滅動力學(xué)試驗檢測YFP-H148Q/V163S對其氯離子的敏感性。測序結(jié)果顯示，YFP（yellow fluorescent protein）特異編碼序列上第508-510位堿基CAC突變?yōu)镃AG，148位組氨酸H突變?yōu)楣劝滨０稱；第553-555位堿基GTG突變?yōu)锳GC，163位纈氨酸V突變?yōu)榻z氨酸S。熒光淬滅動力學(xué)試驗結(jié)果顯示，向表達(dá)YFP-H148Q/V163S的FRT細(xì)胞加入Ano1激活劑ionomycin和Cl-，其相對熒光強度明顯下降。pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表達(dá)載體成功構(gòu)建，并證實表達(dá)于FRT胞漿中的YFP-H 148Q/V163S具有對氯離子敏感的特性。

YFP-H148Q/V163S；FRT；相對熒光強度

氯離子是機體內(nèi)含量最多的陰離子，可通過跨膜轉(zhuǎn)運改變細(xì)胞內(nèi)外的氯離子濃度來維持細(xì)胞外液滲透壓和細(xì)胞正常功能。氯離子通道（cal?cium-activated chloride channels，CaCCs）是一類廣泛表達(dá)機體多種細(xì)胞膜上可通透Cl-的陰離子通道，是多種疾病診斷的生物標(biāo)志物和治療的潛在藥物靶點[1]。傳統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子的方法常用氯離子敏感的熒光染料，但易出現(xiàn)熒光漂白現(xiàn)象，重復(fù)操作易污染細(xì)胞[2]。近年來從水母提取出來的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為新型的分子標(biāo)記物備受青睞，具有通用性好、細(xì)胞毒性低、在活細(xì)胞內(nèi)可長久表達(dá)、并且相對熒光信號不易發(fā)生淬滅等特性[3-4]，此外在一系列基于GFP的生物傳感器已經(jīng)成為檢測活細(xì)胞內(nèi)離子活動的一個重要工具[5]。相關(guān)文獻(xiàn)報道對黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）進(jìn)行一系列點突變，改變其氨基酸組成可提高其對氯離子親和力[6]，因

此本實驗構(gòu)建黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）突變體的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163，研究YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性，對細(xì)胞內(nèi)外氯離子的測定和檢測氯離子通道開放情況等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 pRSETB-YFP和pcDNA3.1由大連醫(yī)科大學(xué)麻彤輝教授饋贈；QuickchangeTM點突變試劑盒，購自Stratagene公司；穩(wěn)定表達(dá)pEGFPAno1的FRT細(xì)胞由本實驗室前期制備；Lipofectamine LTX，購自Invitrogen公司；NMDG-Cl、MgCl2、MnCl2、CdCl2、GdCl3、glucose、HEPES和70d-mannitol，購自BBI公司；Ionomycin和T16Ainh-A01，購自Sigma公司；倒置熒光顯微鏡，購自Nikon公司；FluoStar Optima多功能酶標(biāo)儀，購自德國BMG LABTECH；引物和測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 YFP-pcDNA3.1質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以pR?SETB-YFP為模板，PCR擴增YFP基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，BamH I和Not I雙酶切目的片段和pcDNA3.1載體，酶切產(chǎn)物切膠回收后T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將pcDNA3.1-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測定濃度，酶切鑒定正確后回收陽性片段，并送測序公司鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)YFP特異編碼序列，分別設(shè)計第148位和163位氨基酸定點突變引物a和b，見表1。

表1 YFP-H148Q/V163S雙突變體的引物設(shè)計

以pcDNA3.1-YFP為模板，利用引物a參照點突變試劑盒說明書構(gòu)建YFP-H148Q突變體。限制性內(nèi)切酶DpnI純化突變產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化E.coli XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切和測序步驟與上述大致相同。以pcDNA3.1-YFP-H148Q為模板，用引物b突變合成pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S，步驟與YFP-H148Q突變步驟一致。

1.2.3 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FRT細(xì)胞 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine LTX以0.5μg：2.5μL配比稀釋后充分混勻，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Ano1的FRT細(xì)胞，48 h后觀察YFP-H148Q/V163S在FRT細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.2.4 熒光淬滅動力學(xué)試驗 選取轉(zhuǎn)染效率高的FRT細(xì)胞，用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，每次200 μL，最后一次留50μL PBS。利用FluoStar Optima多功能酶標(biāo)儀，以5 s/點的速度連續(xù)測定14 s，記錄下胞漿相對熒光強度隨時間變化的動態(tài)曲線。前2 s為基線，2 s后以170μL/s的速度向96孔板中每孔注入200μmol/L ionomycin和120μL的高Cl-溶液，繼續(xù)測定12 s。不加ionomycin的高Cl-溶液和加Ano1抑制劑T16Ainh-A01的高Cl-溶液作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質(zhì)粒酶切和測序結(jié)果 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Not I雙酶切產(chǎn)生2條清晰條帶，大小分別與pcDNA3.1載體片段（5 597 bp）和YFP片段（729 bp）相符（見圖1）。測序結(jié)果經(jīng)NCBI與YFP序列Blast顯示YFP突變位置，YFP序列第508-510位堿基CAC突變?yōu)镃AG，組氨酸H突變?yōu)楣劝滨０稱；第553-555位堿基GTG突變?yōu)锳GC，纈氨酸V突變?yōu)榻z氨酸S（見圖2）。酶切與測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建YFPH148Q/V163S真核表達(dá)載體。

圖1 YFP-H148Q/V163S酶切1：BamH I單酶切；2：Not I單酶切；3：BamH I/Not I雙酶切；4：YFP-H148Q/V163S；M：Trans2K Plus DNAMarker

圖2 YFP突變位置示意

2.2 轉(zhuǎn)染前后FRT細(xì)胞形態(tài)特點 轉(zhuǎn)染前期已將Ano1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRT細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞膜上發(fā)出綠色熒光，證實FRT細(xì)胞已穩(wěn)定表達(dá)Ano1。見中插彩版圖3A和B。轉(zhuǎn)染YFP-H148Q/ V163S后胞漿可見到黃色熒光，證實YFP-H148Q/ V163S在FRT胞漿內(nèi)表達(dá)。見中插彩版圖3C。

2.3 熒光淬滅動力學(xué)試驗結(jié)果 轉(zhuǎn)染后FRT細(xì)胞中加入含ionomycin的高Cl-溶液，結(jié)果表明，F(xiàn)RT胞漿中相對熒光強度顯著下降（見圖4A）。不加ionomycin的高Cl-溶液和加Ano1抑制劑T16Ainh-A01的高Cl-溶液注入后相對熒光強度均不變，（見圖4B）。結(jié)果證實，YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性。

3 討論

圖4 熒光淬滅動力學(xué)試驗A：加入ionomycin后熒光淬滅動力學(xué)試驗結(jié)果；B：未加ionomycin和加入T16Ainh-Aol后熒光淬滅動力學(xué)試驗結(jié)果

正常生理條件下哺乳動物細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度＜40mmol/L且相對比較穩(wěn)定[7]，YFP對細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度變化敏感程度不高。相關(guān)研究表明，YFP序列上的氨基酸單突變體可提高YFP對氯離子的親和力，生物信息學(xué)和后續(xù)研究表明YFP相應(yīng)的雙突變體具有更強的氯離子敏感性。本試驗采用PCR定點突變技術(shù)[8]成功將第148位組氨酸H突變?yōu)楣劝滨０稱，第163位纈氨酸V突變?yōu)榻z氨酸S。Ano1（TMEM16A）是表達(dá)在細(xì)胞膜上的一種鈣激活氯離子通道[9]，將YFP-H148Q/ V163S轉(zhuǎn)染入在前期工作我們已經(jīng)建立了穩(wěn)定表達(dá)Ano1的FRT細(xì)胞模型，熒光淬滅動力學(xué)實驗證實YFP-H148Q/V163S對Cl-具有敏感性。

氯離子及氯離子通道在多種生理功能和病理過程中發(fā)揮重要作用[1-7]，發(fā)展敏感、簡便的氯離子濃度測定方法不僅可檢測細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度的動態(tài)變化，而且可同時反映氯離子通道的功能狀態(tài)，可極大促進(jìn)該領(lǐng)域的研究。本實驗證實了YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性，可用以發(fā)展監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)氯離子動態(tài)變化的特異性生物傳感器，為后期純化蛋白研制檢測氯離子濃度試劑盒和開發(fā)高通量細(xì)胞檢測技術(shù)具有重要意義。YFP-H148Q/V163S感受氯離子跨膜轉(zhuǎn)運引起的胞質(zhì)中氯離子濃度變化，能夠反映Ano1的開放情況及功能狀態(tài)，為后續(xù)研究Ano1鈣激活氯離子通道以及其他氯離子通道的開放情況與調(diào)節(jié)劑的篩選奠定基礎(chǔ)。

[1]Bill A，Hall M L，Borawski J，et al.Smallmolecule-facilitated degradation of ANO1 protein：a new targeting approach for anti?cancer therapeutics[J].JBiol Chem，2014，289（16）：11029-41.

[2]Kornreich BG.The patch clamp technique：principles and techni?cal considerations[J].JVet Cardiol，2007，9（1）：25-37.

[3]Pan Y，Leifert A，Graf M，etal.High-sensitivity real-time analy?sis ofnanoparticle toicity in green fluorescentprotein-express?ing zebrafish[J].Small，2013，9（6）：863-869.

[4]辛文文，王景林.基于熒光檢測的新型細(xì)胞傳感器[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2011，38（2）：185-190.

[5]Galietta L J，Haggie P M，Verkman A S.Green fuorescent pro?tein-based halide indicators with improved chloride and iodide af?finities[J].FEBSLett，2001，499（3）：220-224.

[6] George Patterson，Rich N.Day，David Piston.Fluorescent protein spectra[J].Cell Science，2001，11（5）：837-838.

[7]Hong L，Xie Z Z，Du Y H，et al.Alteration of volume-regulated chloride channel during macrophage-derived foam cell formation in atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2011，216（1）：59-66.

[8]張金鳳，侯振中.TEAD1和YAP1對牛干擾素Tau基因表達(dá)調(diào)控的試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：26-29.

[9]Terashima H，Picollo A，Accardi A.Purified TMEM16A is suffi?cient to form Ca2+-activated Cl-channels[J].Proc Natl Acad SciU SA，2013，110（48）：19354-19359.

[10]Filippin L，Abad M C，Gastaldello S，et al.Improved strategies for the delivery of GFP-based Ca2+sensors into themitochondrial matrix[J].Cell Calcium，2005，37（2）：129-136.

Expression and app lication of YFP-H148Q/V163Sas chloride ion Sensor in FRT cells

ZHENG Kai，ZHANG Yun-qiao，XU Hui-jing，F(xiàn)ANG Fang，YANG Zi-yan，ZHENG Yan，DONG Xiao-ru，LIRong-xia，HAO Feng
（DepartmentofMedicine Laboratory，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

To study the chloride ion sensitivity of YFP-H 148Q/V163S in FRT cells，pcDNA3.1-YFP-H 148Q/V163 was con?structed using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.YFP-H148Q/V163Swas transfected into FRT cells stably express?ing Ano1 by liposome.The chloride ion sensitivity of YFP-H148Q/V163Swas detected by the fluorescence quenching kinetics test. Sequence analysis indicated that CAC at 508-510 bp site of YFP was substituted for CAG，in which the 148-amino acid H was substituted for Q；GTG at553-555 bp sitewas substituted for AGC,in which the 163-amino acid V was substituted for S.The re?sults of fluorescence quenching kinetics test confirmed that the relative fluorescence intensity of YFP-H148Q/V163Swas signifi?cantly decreased upon the addition of ionomycin and extracellular Cl-.pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163 was successfully established and YFP-H148Q/V163S in FRT cellswas significantly sensitive to chloride ion.

YFP-H148Q/V163S；FRT；the relative fluorescence intensity

HAO Feng

Q785.786，Q256

A

0529-6005（2015）11-0006-03

2015-03-24

吉林省衛(wèi)生計生科研計劃（2014Z103）；吉林省教育廳基金資助課題（2013-351）；國家自然科學(xué)基金資助項目（812022031）；2013年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃；吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助課題[吉醫(yī)學(xué)科字（2012）第12號]

鄭鍇（1980-），女，講師，碩士，研究方向為氯離子通道結(jié)構(gòu)和功能的研究，E-mail：carane@163.com

郝峰，E-mail：haof863@126.cn