蘇丹萍，李 冰，，張顯浩，陳瑞愛，，蔡佳躍，賀東生，

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東 云浮 527400）

2012-2014年我國南方地區(qū)豬流行性腹瀉病毒遺傳進(jìn)化分析

蘇丹萍1，李 冰1，2，張顯浩2，陳瑞愛1，2，蔡佳躍2，賀東生1，2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東 云浮 527400）

為分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的遺傳變異情況，本試驗(yàn)對(duì)2012-2014年我國南方地區(qū)7個(gè)省市17份PEDV陽性樣品的S基因主要的中和表位區(qū)（COE）序列進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測序，并與國內(nèi)外的代表性毒株進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，本研究中的17株P(guān)EDV毒株COE中有16株屬于第Ⅰ大群，而GD/FSss/2014屬于第Ⅱ大群，所有COE的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.9%～99.8%和88.6%～100%，它們與經(jīng)典毒株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.3%～99.5%和90%～98.6%，與疫苗株CV777 Vaccine的核苷酸和氨基酸同源性分別為95%～97.1%和92.9%～97.9%。COE的氨基酸序列發(fā)生了不同程度的點(diǎn)突變，為PEDV遺傳進(jìn)化分析和疫病防制提供了新的參考。

豬流行性腹瀉病毒；主要中和表位區(qū)；南部地區(qū)；遺傳進(jìn)化

PEDV主要基因編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：S基因編

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）

碼纖突蛋白（Spike，S）、E基因編碼小包膜蛋白（Envelop，E）、M基因編碼膜蛋白（Membrane，M）、N基因編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）[4]。其中S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合、膜融合和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體等方面發(fā)揮重要生物學(xué)作用[5]。Chang SH等根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S基因的中和表位區(qū)鑒定出PEDV S基因的一個(gè)中和表位區(qū)（Core neu?tralizing epitope，COE，aa499-aa638）[6]。有研究表明，S基因在分析PEDV流行毒株的遺傳變異和流行情況中發(fā)揮重要作用，而對(duì)PEDV COE的變異分析更能反應(yīng)病毒免疫原性的變化情況[7]。本試驗(yàn)對(duì)我國南方地區(qū)2012-2014年采集并鑒定的17株P(guān)EDV的COE進(jìn)行了克隆、測序，并對(duì)其遺傳變異情況進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集2012-2014年間廣東、四川、浙江等7個(gè)省的不同的暴發(fā)嚴(yán)重腹瀉的疑似感染PEDV豬場的仔豬的小腸或糞便樣品，總共17份樣品。

1.2 試劑材料 總RNA抽提試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品，PrimerScriptOne Step RT-PCR Kit、pMD-19T克隆載體為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。

1.3 樣品中PEDV的RT-PCR檢測 病料樣品經(jīng)處理后，提取其總RNA，具體操作按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit說明書進(jìn)行。以抽提的RNA為模板，利用PrimerScript One Step RT-PCR Kit II進(jìn)行RT-PCR檢測，確定PEDV陽性樣品。檢測和測序用引物和反應(yīng)程序參照田野等文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行[8]。

1.4 PEDV COE的克隆與測序 以PEDV陽性RNA樣品為模板對(duì)COE序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。凝膠回收PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性重組菌株送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，將所測序列上傳GenBank序列庫。

1.5 遺傳進(jìn)化分析 利用DNAStar和BioEdit軟件將17株P(guān)EDV COE測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)；利用Clustalx1.8和MEGA 4.0對(duì)這17個(gè)序列與國內(nèi)外已發(fā)表的22株P(guān)EDV進(jìn)行同源性比較（見表1），并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PEDV S基因COE序列分析 將RT-PCR擴(kuò)增所得的17個(gè)PEDV COE進(jìn)行測序分析，所有17個(gè)COE序列全長為420個(gè)核苷酸，編碼140個(gè)氨基酸。

表1 本試驗(yàn)中所用到的序列

把17個(gè)COE與國內(nèi)外PEDV參考毒株進(jìn)行同源性分析，本試驗(yàn)中17個(gè)COE核苷酸序列之間的同源性為92.9%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸序列之間的同源性為88.6%～100%；與經(jīng)典毒株CV777株的核苷酸同源性為93.3%～99.5%，氨基酸的同源性為90%～98.6%；與CV777Vaccine株的核苷酸同源性為95%～

97.1%，氨基酸的同源性為92.9%～97.9%。與CV777 Vaccine株相比，17個(gè)COE氨基酸出現(xiàn)了以下一些主要的氨基酸點(diǎn)突變：L3→S3，A19→S19，T51→S51，K65→N65，G96→S96，G111→V111，Q135→E135；此外，其余個(gè)別毒株在5、22、23、25、29、68、69、80、93、101、107、110、114、122、123、137等點(diǎn)位發(fā)生氨基酸點(diǎn)突變，結(jié)果詳見圖1。

圖1 COE氨基酸序列比對(duì)

圖2 PEDV COE序列的遺傳進(jìn)化樹

2.2 PEDV S基因COE序列遺傳進(jìn)化分析 將所測得的17個(gè)毒株序列與國內(nèi)外已發(fā)表的23株P(guān)EDV的COE序列進(jìn)行比較，并建立了遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，39個(gè)COE可分為3個(gè)群：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中有16個(gè)COE基因與BJ-2011-1、NPLPEDv、CV777 Vaccine、Attenuated DR13等屬于第Ⅰ群，GD/FSss/2014與CV777、DR13等屬于第Ⅱ群，KNU-0801、Chinju99屬于第Ⅲ群。

3 討論

2010年10月以來，PED已在全國各豬場普遍流行，并主要侵害7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，發(fā)病率和死亡率高達(dá)60%～100%；該病夏季高溫時(shí)也有發(fā)生與流行，已無明顯的季節(jié)性，并且反復(fù)發(fā)作，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損害。2013年以來，美國也發(fā)生了類似的PED疫情，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。

PEDV S基因編碼的S蛋白是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染宿主機(jī)體后介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，在免疫反應(yīng)中起重要作用。COE是S基因中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位區(qū)，有研究表明，運(yùn)用

COE分析PEDV流行毒株的流行趨勢(shì)、抗原性的變異和遺傳變異情況與運(yùn)用S基因有很高的相似性，但具有省時(shí)、省力和節(jié)省開支等優(yōu)點(diǎn)[10]。

本試驗(yàn)中，2012-2014年上半年間，我們采集了我國南部地區(qū)7個(gè)省市不同的暴發(fā)嚴(yán)重腹瀉的疑似感染PEDV豬場的仔豬的小腸或糞便樣品17份，經(jīng)RT-PCR及測序鑒定確定均感染PEDV，并對(duì)S基因COE序列進(jìn)行序列和遺傳進(jìn)化分析，對(duì)PEDV的流行病學(xué)和抗原性的深入研究提供參考。有研究表明，PEDV的COE是高度保守的[6]，而本研究中的17株P(guān)EDV COE序列與CV777 Vac?cine比對(duì)結(jié)果表明，這些毒株COE的氨基酸序列發(fā)生了不同程度的點(diǎn)突變現(xiàn)象，點(diǎn)突變的數(shù)目在3～10個(gè)之間，這些點(diǎn)突變是否會(huì)影響到病毒的抗原特性，是否會(huì)導(dǎo)致差的交叉保護(hù)，還有待于進(jìn)一步的研究。

根據(jù)PEDV COE序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹將PEDV毒株分為3個(gè)主要的大群，我國主要流行的毒株和本研究中的16株毒株均屬于第Ⅰ群，與美國分離株NPL/PEDv/2013和泰國分離株08CB03-2008等屬于同一群，與其親緣關(guān)系較近，與韓國分離株KNU-0801、Chinju99親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雖然第Ⅰ群的遺傳背景較為復(fù)雜，但是它們與CV777 Vaccine、Attenuated DR13等弱毒株也處于同一大群中，親緣關(guān)系較近。GD/FSss/2014與CV777、DR13等屬于第Ⅱ群，與其余16株毒株有一定的遺傳距離，GD/FSss/2014 COE的氨基酸點(diǎn)突變也較多，可對(duì)其做更進(jìn)一步的研究。

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Genetic variation analysisof porcine epidem ic diarrhea virus in the southern region of China during 2012 to 2014

SU Dan-ping1，LIBing1，2，ZHANG Xian-hao2，CHEN Rui-ai1，2，CAIJia-yue1，HEDong-sheng1，2
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Dahuanong Animal Health Products CO.，LTD，Yunfu 527400，China）

In this study，in order to investigate the variation in the core neutralizing epitope（COE）of Sgene of porcine epi?demic diarrhea virus（PEDV），a total of 17 PEDV positive sampleswere collected from different breeding farms from 7 provinces in the southern region of China during 2012 to 2014，and the COEs were amp lified by RT-PCR，cloned and sequenced.Sequence analysis and genetic variation of 17 COEs were compared with other PEDV

trains selected from GenBank.Our results showed that 16 of 17 strainswere closely related to each other and belonged to the first group，and the GD/FSss/2014 strain be?longed to the second group.Sequence analysis showed that the COE of 17 strains shared 92.9%～99.8%nucleotide and 88.6%～100%deduced amino acid identities to each other，and exhibited 93.3%～99.5%nucleotide and 90%～98.6%deduced amino ac?id identitywith the reference PEDV strain of CV777.Compared with the CV777 vaccine strain，the strains sequenced in this study had 95-97.1%nucleotide and 92.9～97.9%deduced amino acid identity.Meanwhile，therewere some amino acidmutations in the COE.This study could provide the theoretical foundation for selection and further study of comprehensive prevention and control of PEDV.

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）；the core neutralizing epitope（COE）；the southern region of China；genetic evolution

s：HEDong-sheng；CHEN Rui-ai是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死性為主要特征[1]。自1971年比利時(shí)和英國首次報(bào)道PED之后，在世界各地陸續(xù)發(fā)生[2]。近幾年P(guān)ED在我國頻繁暴發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

S852.65+1

A

0529-6005（2015）11-0012-04

2014-10-10

廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司2012年科研項(xiàng)目

蘇丹萍（1965-），女，實(shí)驗(yàn)師，本科，主要從事獸醫(yī)傳染病學(xué)的研究，E-mail：sdp8528@163.com

賀東生，E-mail：Dhe@scau.edu.cn；陳瑞愛，E-mail：chensa727@126.com