向王震，肖 進，，王璐瑤，李 靜，巴利民，齊 鵬，汪 明，

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100095；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心 中牧實業(yè)股份有限公司研究院，北京 海淀 100070）

牛主要組織相容性復合物BoLA基因研究進展

向王震1，肖 進1，2，王璐瑤1，李 靜1，巴利民2，齊 鵬2，汪 明1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100095；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心 中牧實業(yè)股份有限公司研究院，北京 海淀 100070）

牛主要組織相容性復合體MHC（BoLA）與移植排斥反應和免疫反應密切相關，是免疫學研究的重要內(nèi)容。本文簡述了牛BoLA分布、結(jié)構(gòu)及其功能，介紹BoLA與疾病易感性，免疫應答調(diào)控之間的關系及表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)方面的研究。

1 簡介

主要組織相容性復合物（major histocompati?bility complex，MHC）是動物體內(nèi)由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座位所組成的一個基因家族。MHC基因產(chǎn)物稱為MHC抗原，是一類存在于細胞表面的糖蛋白，主要負責連接和遞呈抗原性多肽給T淋巴細胞。因此對MHC基因表達的分析是免疫應答與調(diào)控相關研究的重要內(nèi)容。

2 BoLA基因及其表達產(chǎn)物

Amorena B.[1]等（1978）首次報道牛的MHC I類抗原，并將牛MHC系統(tǒng)命名為牛白細胞抗原系統(tǒng)（bovine leucocyteantigen，BoLA）。此后，Letesson等發(fā)現(xiàn)BoLAⅡ類抗原。隨著分子生物學的發(fā)展，大量分子生物學技術手段被運用來進行BoLA基因的研究。

BOLA基因位于牛的第23號染色體[2]，主要分為BoLA-Ⅰ類，BoLA-Ⅱ類，BoLA-Ⅲ類基因。Bo?LA-Ⅰ類區(qū)域包含約1 550 kb大小基因片段，且該區(qū)域有兩個緊密聯(lián)系的基因表達座位BoLA-A和BoLA-B[3]。BoLA-Ⅰ類分子幾乎分布于所有有核細胞表面。大多數(shù)組織和細胞都具有較高濃度的BoLA-Ⅰ類分子分布，其中T淋巴細胞、B淋巴細胞以及單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞濃度最高。BoLA-Ⅰ類抗原由一條α鏈和一條β鏈非共價鍵結(jié)合而成。α鏈為重鏈，分子量為44 kDa，含346個氨基酸殘基，由α1功能區(qū)、α2功能區(qū)、α3功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞區(qū)質(zhì)組成。β鏈為輕鏈，分子量為12 kDa，游離于細胞膜外通過非共價鍵與α鏈結(jié)合。BoLA-Ⅰ類分子的主要功能是進行內(nèi)源性抗原的呈遞。BoLA-Ⅰ類分子的溝槽可與細胞內(nèi)被蛋白酶體加工過的內(nèi)源性抗原以氫鍵結(jié)合，并將其呈遞給T細胞，引發(fā)免疫反應。BoLA-Ⅰ類分子結(jié)合的多肽一般為8-11個氨基酸。

BoLA-Ⅱ類基因靠近牛23號染色體的著絲點。Ⅱ類基因分為兩個亞區(qū)-Ⅱa和Ⅱb。Ⅱa包括DR基因和DQ基因。DR基因含DRA、DRB1、DRB2和DRB3四個基因座位，DQ基因至少含有DQA1、DQA2、DQB1和DQB2等四個基因座位；Ⅱb區(qū)域包括DMA，DMB，LMP2，LMP7和TAP等基因，它們參與抗原遞呈和傳輸?shù)倪^程。其他基因DNA，DOB，DIB，DYA和DYB，目前具體功能還不明確[4]。BoLA-Ⅱ類基因的編碼產(chǎn)物稱為BoLA-Ⅱ類分子。BoLA-Ⅱ類分子是由一條重鏈（α鏈）和一條輕鏈（β鏈）以非共價鍵結(jié)合而成的復合物。這兩條鏈都是跨膜結(jié)構(gòu)，α鏈和β鏈的化學結(jié)構(gòu)極為相似，只是α鏈稍大于β鏈，其分子量分別為33 kDa和28 kDa。X-衍射晶體結(jié)構(gòu)分析表明α鏈和β鏈在細胞外分別含有兩個功能區(qū)α1、α2，和β1、β2，每個功能區(qū)分別由約90個氨基酸殘基組成。BoLA-Ⅱ類分子的主要作用是遞呈外源性抗原多肽，其遞呈抗原肽長度大約為12～18個氨基酸殘基，最長可達28個[5-6]。

BoLA-Ⅲ類基因由一組不同種類的基因構(gòu)成，這些基因與免疫功能相關，負責編碼補體成分B因子和C4，類固醇21-羥化酶，熱休克蛋白70以及腫瘤壞死因子α和β。目前對于BoLA-Ⅲ類基因及其表達產(chǎn)物的研究較少[4]。

3 BOLAⅡ類a亞區(qū)DR基因

DR基因含DRA、DRB1、DRB2和DRB3四個基因座位。DRA基因編碼DR分子的α鏈，BoLA-DRA由于只有一個等位基因被報道，所以一直以來被認為是單形態(tài)。然而，近期的一些研究表明，牛

的DRA座位出現(xiàn)了等位變異。相比之下，編碼DR分子β鏈的DRB基因具有高度多態(tài)性。多態(tài)性主要集中在編碼多肽結(jié)合位點可變部分的第二外顯子。牛有至少3個DRB基因座位，但僅僅BoLADRB3基因是有功能的。BoLA-DRB1是假基因，在β1和橫跨膜區(qū)域攜帶終止密碼子，其基本不具多態(tài)性。BoLA-DRB2在所有基因表達時表達水平很低，不具備多態(tài)性[7]。

3.1 牛DRB3基因座位的多態(tài)性 目前研究多集中在BoLA-DRB3基因多態(tài)性方面。大量研究報道了在DRB3的第二外顯子位點存在高度多態(tài)性，并且不同品種牛該位點等位基因的頻率各不相同（表1）[6]。

DRB3基因座位的多態(tài)性研究具有重要意義，因為這個區(qū)域存在著抗原遞呈位點并且該區(qū)域的多態(tài)性可能與不同個體面對特殊病原時激發(fā)不同水平免疫應答有關。很多研究報道了某一個或多個BoLA-DRB3.2等位基因與機體對某些傳染病的抗病性的關系（表2）[6]。

表1 不同牛品種DRB3.2基因座位上頻率高于0.05的等位基因

3.2 DRB3.2基因座位的多樣性和疫苗接種 觀察BoLA-Ⅱ類DRB3基因座位等位基因的多樣性是否影響不同個體在疫苗接種后保護力的相關研究已經(jīng)開展。Ballingal K T[8]等報道，在與子孢子P67抗原發(fā)生免疫反應之后，BoLA-Ⅱ型DRB3*2703和DRB3* 1501等位基因和面對小泰勒蟲威脅時的保護力水平相關。Baxter[9]等報道，BoLA-DR分子肽結(jié)合口袋對于牛口蹄疫合成肽疫苗設計意義重大。研究表明，BoLA-DRB3等位基因的結(jié)合口袋與針對口蹄疫病毒VP1基因表達的四十肽的免疫應答相關。位于DR分子多肽結(jié)合區(qū)域不同位點的幾個氨基酸和抗體應答水平重要相關。進一步的分析表明，結(jié)合口袋的特殊殘基對于疫苗設計至關重要。

3.3 MHCⅡ類分子的多肽結(jié)合位點 Srinivasan M[10]等證明，每個抗原遞呈細胞結(jié)合加工抗原的MHCⅡ類受體分子數(shù)目很少，并且這個量足以激活T淋巴細胞。另外，Chicz RM[11]等報道，利用高效液相色譜，質(zhì)譜法和微測序分析法對酸洗脫的肽段與HLA-DR1結(jié)合的特點進行研究。多肽相對分子質(zhì)量在1 602到2 996之間（13～25個殘基）。Mouritsen S[12]等利用等電子聚焦分離MHCⅡ類分子和其結(jié)合的自身多肽來研究MHCⅡ類分子與肽段結(jié)合的特點。他們觀察到從某一種等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子上洗脫下來的肽段能夠與相同等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子結(jié)合，而不能與不同等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子結(jié)合。

表2 在不同品種牛中不同疾病和BOLA-DRB3.2等位基因的關系

有關肽段與MHCⅡ類分子結(jié)合特點的研究具有重要意義，這將有助于我們更好的明白這種結(jié)合的方式，對于構(gòu)想設計疫苗來提高動物機體面對傳染病威脅時的保護力至關重要。

4 BoLA表達蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

2010年，第一個BOLA I類分子N*01301與泰勒原蟲免疫優(yōu)勢表位的結(jié)構(gòu)被解析出來。對其遞呈的優(yōu)勢表位構(gòu)象的分析揭示了該MHC I類表型易引發(fā)強有效免疫反應的結(jié)構(gòu)基礎。值得注意的是，BoLA等位基因表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析目前在國內(nèi)研究得較少。2011年，夏春[13]等利用X射線衍射技術，解析了BoLAⅠ類N*01801基因表達蛋白與牛瘟病毒來源的抗原肽復合物的晶體結(jié)構(gòu)，并且分析了遞呈的抗原肽兩種不同的構(gòu)象。他們發(fā)現(xiàn)第73位異亮氨酸是靈活可變的，允許MHC分子凹槽適應不同的構(gòu)象來容納牛瘟病毒來源的抗原肽。這種宿主遞呈抗原的方式有利于創(chuàng)造出一個更為豐富的T細胞受體庫，這對于產(chǎn)生更為有效的細胞毒性T細胞免疫應答意義重大。2014年，夏春[14]等又解析了牛CD8αα分子同遞呈口蹄疫病毒來源肽段FMDV-VP1YY9的BoLA-2*02201 I類分子復合物的結(jié)構(gòu)。國外有學者認為，與BoLA分子結(jié)合的抗原肽氨基酸殘基替換后能夠?qū)е碌任换虻鞍妆磉_產(chǎn)物獨特空間構(gòu)象發(fā)生變化，進而影響免疫應答過程中保護性抗體的表達量[15]。這對設計合成肽疫苗激發(fā)更為有效免疫應答有著重要啟示意義。目前，已報道有3個BoLAⅠ類相關分子結(jié)構(gòu)被解析，而還沒有BoLA II類分子結(jié)構(gòu)被解析出來的相關報道。

5 展望

MHC分子在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。Ⅱ類分子廣泛的結(jié)構(gòu)多態(tài)性是造成同一種群中不同個體針對傳染性病原體產(chǎn)生不同免疫應答的原因。而DRB3基因的第二外顯子的高度多態(tài)性可能有助于鑒別抗病性強的單倍型。對主要組織相容性復合體（MHC）的研究也有助于開發(fā)和設計含有病原體的一種或多種T細胞表位的合成肽疫苗。這將給動物機體提供更好的保護力，給未來傳染病防控提供更為有效的措施。

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S823

A

0529-6005（2015）11-0072-03

2014-10-20

向王震（1990-），男，碩士，從事預防獸醫(yī)學研究，E-mail：13141319644@163.com

汪明，E-mail：vetdean@cau.edu.cn