段 燁，高志強(qiáng)，王慧珊，張鶴曉，李 灝

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 朝陽(yáng) 100029；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽(yáng) 100026；3.北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400）

核酸適體技術(shù)及其在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

段 燁1，高志強(qiáng)2，王慧珊3，張鶴曉2，李 灝1

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 朝陽(yáng) 100029；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽(yáng) 100026；3.北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400）

近年來(lái)，隨著食品安全事件的頻繁發(fā)生，獸藥殘留已逐漸成為人們普遍關(guān)注的一個(gè)社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)的獸藥殘留檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等，這些方法其具有檢測(cè)靈敏度較高、穩(wěn)定性較好等特點(diǎn)，但對(duì)樣品潔凈度的要求較高以及檢測(cè)成本較高，使得這幾種檢測(cè)方法無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢的要求。因此，人們有必要開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)單、快速、有效的獸藥殘留檢測(cè)方法。

核酸適體（aptamer），取自于拉丁文的“aptus”（意為適合）與希臘單詞“meros”，中文譯為“適體”、“適配子“或“核酸適體”[1]。適體的功能類似于抗體，適體-靶分子的結(jié)合與抗原-抗體的結(jié)合相似，同樣具有高度特異性，此外，適體還具有許多明顯優(yōu)于抗體的特性：（1）適體的靶分子范圍非常廣泛；（2）適體的親和力強(qiáng)、特異性高；（3）適體穩(wěn)定性好。

正是基于核酸適體的上述優(yōu)點(diǎn)，核酸適體技術(shù)在分析化學(xué)[2]、臨床[3]、食品安全[4]、分子識(shí)別[5]、藥物篩選[6]及藥物殘留檢測(cè)等方面都展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。本文就核酸適體技術(shù)及其在獸藥殘留檢測(cè)分析中的應(yīng)用進(jìn)展及相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 核酸適體技術(shù)及其研究進(jìn)展

核酸適體技術(shù)主要運(yùn)用由Tuerk和Gold等人于1990年建立的指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential en?richment，SELEX），對(duì)體外人工合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫(kù)進(jìn)行反復(fù)篩選，從而獲得能以極高親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列[7]。

1.1 SELEX技術(shù)原理及步驟 SELEX技術(shù)原理如圖1所示，通過(guò)重復(fù)篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或親和力較低的DNA或RNA分子被洗脫，而與靶物質(zhì)具有高親和力的DNA或RNA（適體）被從起初隨機(jī)文庫(kù)中分離出來(lái)，且其純度隨SELEX過(guò)程的進(jìn)行而增高，從pmol級(jí)到nmol級(jí)，最終占據(jù)庫(kù)的大多數(shù)（＞90%）。

1.2 核酸適體篩選中的分離方法 如何分離與

靶物質(zhì)結(jié)合的寡核苷酸分子是篩選過(guò)程的關(guān)鍵，但是在實(shí)際篩選中，SELEX技術(shù)往往受到篩選環(huán)境及技術(shù)本身限制，影響分離效果和篩選效率。近年來(lái)，研究人員在傳統(tǒng)SELEX基礎(chǔ)上，發(fā)展出許多不同的篩選分離方法。

圖1 SELEX流程

1.2.1 硝酸纖維素膜（Nitrocellulose filtermembrane，NC）過(guò)濾法 硝酸纖維素膜過(guò)濾法利用NC膜能吸附蛋白而不吸附游離DNA的特性，將共孵育的混合物經(jīng)NC膜用真空抽吸過(guò)濾，與靶分子結(jié)合的寡核苷酸分子滯留在濾膜上，而未結(jié)合靶分子的游離寡核苷酸分子則被濾除掉。經(jīng)洗滌、剪碎濾膜，利用洗脫、乙醇沉淀等回收與NC膜結(jié)合的寡核苷酸分子。劉曉靜[8]于2004年用硝酸纖維素膜過(guò)濾法篩選到了人TGF-βRII核酸適體。該法操作簡(jiǎn)單、成本低，無(wú)需特殊設(shè)備；但此法不能應(yīng)用于較小的靶分子，且對(duì)具有豐富構(gòu)象的隨機(jī)寡核苷酸序列有較強(qiáng)的背景吸附。

1.2.2 親和柱法 親和柱法是將靶分子通過(guò)共價(jià)鍵或親和力連接到凝膠樹(shù)脂上，將隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)灌注層析柱，其與靶分子在層析柱上作用一定時(shí)間后，用沖洗緩沖液進(jìn)行沖洗，與靶物質(zhì)結(jié)合的文庫(kù)序列會(huì)滯留在樹(shù)脂上，未結(jié)合序列則流出層析柱，最后加入洗脫液洗脫下結(jié)合序列，即可獲得相應(yīng)的核酸適體。該法操作簡(jiǎn)便，能適用于小分子靶物質(zhì)的核酸適體篩選。

2008年秦川[9]把青霉素與Epoxy（環(huán)氧基）活化瓊脂糖凝膠FF偶聯(lián)做固定相，通過(guò)親和柱層析SELEX篩選方法，篩選獲得青霉素的核酸適體。

1.2.3 磁珠法 磁珠可作為固相載體用于SELEX篩選，該法不僅可改善傳統(tǒng)硝酸纖維素膜過(guò)濾法和親和柱法相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低下等問(wèn)題，還可用于分離和建立所篩選的次級(jí)文庫(kù)。1997年，Bruno等人[10]率先將甲苯磺酰基活化的磁珠作為固相載體連接靶蛋白，利用SELEX技術(shù)篩選核酸適體，他們將PCR引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，經(jīng)PCR擴(kuò)增后核酸適體會(huì)被生物素標(biāo)記，加入固定在磁珠上的靶蛋白及鏈親和素就可檢測(cè)每輪篩選文庫(kù)與靶蛋白的結(jié)合力。

1.2.4 聚丙烯微孔板法 聚丙烯微孔板法是將靶分子固定在微孔板上，用牛血清封閉其余的位點(diǎn)，然后加入隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，共孵育之后通過(guò)簡(jiǎn)單洗滌即可除去未結(jié)合的寡核苷酸序列，最后洗脫回收結(jié)合的寡核苷酸序列。2007年，馮香玲[11]將DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）人工抗原吸附在微孔板上，以其作為固定相，經(jīng)過(guò)10輪的篩選和擴(kuò)增，得到了DON特異性的核酸適體。該法操作簡(jiǎn)單，成本低；但篩選效率較低。

1.2.5 毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）法

毛細(xì)管電泳法基于結(jié)合靶分子的寡核苷酸分子電泳遷移速度變緩的原理，進(jìn)行核酸適體的篩選分離。

2004年，Mendonsa等人[12]利用毛細(xì)管電泳成功分離獲得免疫球蛋白IgE的核酸適體。CE-SELEX的出現(xiàn)極大提高了篩選效率和靶蛋白的適體親和力，僅需2-4輪篩選就可獲得靶分子高親和力的ssDNA特異適體。但該法也存在諸如分離量小、不同靶分子的電泳條件需要各自優(yōu)化等缺點(diǎn)，對(duì)不能引起較高電泳遷移率的靶分子如一些小分子、細(xì)胞等的分離效率低下；此外毛細(xì)管電泳儀的低普及程度也限制了CE-SELEX技術(shù)應(yīng)用和推廣。

以上這5種分離方法都有它們的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，要根據(jù)靶分子的性質(zhì)特性以及獲得的核酸適體的用途來(lái)選擇何種分離方法。

2 核酸適體技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)分析中的應(yīng)用

獸藥在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，特別是細(xì)菌病、寄生蟲(chóng)病方面極其重要，有些獸藥作為飼料添加劑在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。獸藥的長(zhǎng)期過(guò)度使用導(dǎo)致了獸藥殘留。獸藥殘留（Residues ofveterinary drug）是指動(dòng)物用藥后，任何可食動(dòng)物源性產(chǎn)品中所含有的原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物，以及與獸藥有關(guān)雜質(zhì)的殘留[13]。殘留在動(dòng)物體內(nèi)的獸藥，可隨食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。核酸適體技術(shù)具有高特異性及靈敏度，可較好地進(jìn)行獸藥殘留檢測(cè)。

2.1 核酸適體技術(shù)在抗生素類藥物檢測(cè)分析中的應(yīng)用 為有效預(yù)防和治療畜禽疾病，抗生素類藥品和飼料被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，然而抗生素濫用，對(duì)環(huán)境安全及人類健康均造成極大威脅。因此，針對(duì)抗生素殘留超標(biāo)的檢測(cè)不容忽視。

由于大部分抗生素都是半抗原，用免疫反應(yīng)獲得其抗體比較困難，但核酸適體技術(shù)的出現(xiàn)為抗生素殘留的檢測(cè)提供了新思路，即以抗生素作為靶物質(zhì)通過(guò)體外篩選其核酸適體，進(jìn)而用于檢測(cè)分析。近年來(lái)，已有多種抗生素的核酸適體被篩選獲得并在檢測(cè)中得以應(yīng)用（表1）。Wochner等人[21]則將所篩選出的柔紅霉素的核酸適體固定于金納米顆粒，構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)人尿液中該藥物的殘留。2009年，Lee等人[22]將他們所篩選的土霉素的核酸適體作為分子識(shí)別元件，利用電化學(xué)生物傳感器對(duì)土霉素進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線范圍為1～100 nmol/L。

表1 部分抗生素核酸適體

2.2 核酸適體技術(shù)在磺胺類藥物以及驅(qū)蟲(chóng)劑類藥物檢測(cè)分析中的應(yīng)用 磺胺類藥物為廣譜抗菌藥，對(duì)許多革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌均有效。在近15-20年，動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留量超標(biāo)現(xiàn)象十分嚴(yán)重，所以對(duì)其檢測(cè)迫在眉睫。2013年，倪姮佳[23]利用SELEX技術(shù)，經(jīng)過(guò)9輪篩選成功獲得磺胺甲基嘧啶的核酸適體，其篩選率約為75%；并建立了基于磺胺甲基嘧啶核酸適體的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。其檢測(cè)限為0.92 nmol/mL，IC50為5.61 ng/mL，線性范圍為1.85～21.57 ng/mL。該方法可成功檢測(cè)牛奶中磺胺甲基嘧啶殘留，其回收率為88.0%～98.2%，變異系數(shù)為10.0%～23.4%。

驅(qū)蟲(chóng)劑類以有機(jī)磷類化合物應(yīng)用最廣泛，可有效殺滅生物機(jī)體內(nèi)外的寄生蟲(chóng)。近幾年來(lái)，核酸適體技術(shù)在驅(qū)蟲(chóng)劑檢測(cè)分析中的應(yīng)用正在興起。例如，王麗等人[24]于2013年利用核酸適體技術(shù)，從一個(gè)固定的隨機(jī)ssDNA庫(kù)中對(duì)甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂(lè)果等4種有機(jī)磷農(nóng)藥的DNA適體進(jìn)行了同時(shí)篩選并建立了檢測(cè)方法。

2.3 核酸適體技術(shù)在激素與其他生長(zhǎng)促進(jìn)劑類檢測(cè)分析中的應(yīng)用 在畜牧生產(chǎn)過(guò)程中，為加快畜禽增長(zhǎng)及出欄率，過(guò)量激素或生長(zhǎng)素經(jīng)常被人為添加。當(dāng)人食用這些含大量激素的肉類食品后，也會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生，甚至導(dǎo)致死亡。因此，很有必要加大對(duì)食品中這些物質(zhì)的檢測(cè)、監(jiān)管力度。為了更快捷、方便的檢測(cè)，科研工作者篩選獲得了多種激素的核酸適體（表2）。Kim等人[25]將17-β雌二醇的核酸適體與電極相連，利用電化學(xué)生物傳感器對(duì)17-β雌二醇進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 核酸適體技術(shù)在其他非法添加物檢測(cè)分析中的應(yīng)用 孔雀石綠曾被許多國(guó)家廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲(chóng)劑和殺菌劑，用以殺滅體外寄生蟲(chóng)和魚卵中的真菌。由于孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，并具有潛在致突變、致畸和致癌的危險(xiǎn)性，故我國(guó)、美國(guó)、加拿大以及歐盟等許多國(guó)家均禁止將其作為獸藥用于人類食用魚。2001年，Grate等人[28]利用RNA適體對(duì)孔雀石綠進(jìn)行檢測(cè)，檢出限可達(dá)到1μmol/L，從此該核酸適體被作為識(shí)別元素用于魚肉組織內(nèi)的孔雀石綠的熒光檢測(cè)。

表2 部分激素核酸適體

此外，各種汞制劑如氯化亞汞、硝酸亞汞、乙酸汞、吡定基乙酸汞，曾被作為有效的殺蟲(chóng)劑而用于動(dòng)物殺蟲(chóng)，但因其劇毒性，現(xiàn)已被禁止作為獸藥繼續(xù)使用。2009年，Xu等人[29]設(shè)計(jì)了6條長(zhǎng)

度為20個(gè)核苷酸且富含T堿基的DNA序列，利用非修飾的納米金建立了基于納米金顏色變化的Hg+檢測(cè)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有4個(gè)T-T堿基對(duì)序列的檢測(cè)效果最好，檢出限可達(dá)0.51μmol/L。

3 展望

核酸適體技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在篩選技術(shù)上不斷豐富和完善，應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展。通過(guò)篩選獲得的核酸適體已被廣泛用于激素類、殺菌劑、抗生素、驅(qū)蟲(chóng)劑等獸藥殘留的檢測(cè)，其檢出限已經(jīng)超過(guò)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏度可完全達(dá)到相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

與其他傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如色譜法、酶標(biāo)法相比，基于核酸適體的檢測(cè)方法有很強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿?，具有操作?jiǎn)單，耗時(shí)短，靈敏度高，成本低廉，且易于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)，非常適用于獸藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。但是核酸適體技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)分析領(lǐng)域依舊面臨著許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，例如，相比于種類繁多的抗體，針對(duì)不同獸藥的核酸適體的種類是有限的，這也是制約核酸適體用于獸藥殘留檢測(cè)發(fā)展的主要瓶頸。

此外，傳統(tǒng)SELEX技術(shù)以小分子為靶分子進(jìn)行篩選時(shí)，通常把靶分子固定在凝膠或者磁珠上，來(lái)實(shí)現(xiàn)分離過(guò)程。但是類似獸藥等小分子，直接固定在基質(zhì)上有一定難度，需要在小分子上引入活性基團(tuán)使其與固相載體結(jié)合。而獸藥靶分子的改造需要保證其活性不被破壞，且不能掩蓋與核酸的結(jié)合位點(diǎn)。因此，如何既能固定靶分子，又能保證靶分子的活性以及其結(jié)合位點(diǎn)不被阻斷，將是未來(lái)的重要研究方向。

總之，隨著核酸適體技術(shù)的不斷進(jìn)步，其在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用也將更為廣泛和深入，必將促進(jìn)獸藥殘留檢測(cè)的發(fā)展。

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S852.65

A

0529-6005（2015）11-0075-03

2014-12-05

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310253）

段燁（1988-），女，碩士生，主要從事生物工程研究，E-mail：duanziling@foxmail.com

李灝，E-mail：lihao@mail.buct.edu.cn