羅 媛， 侯靖宇， 謝玉敏， 朱 迪， 王愛民， 李勇軍， 黃 勇*

（1.貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

紫金透骨噴霧劑的皮膚刺激性、過敏性、急性毒性研究

羅 媛1，2， 侯靖宇2， 謝玉敏2， 朱 迪2， 王愛民3， 李勇軍3， 黃 勇2*

（1.貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

目的 評價紫金透骨噴霧劑皮膚用藥的安全性。方法 采用豚鼠進行皮膚刺激性試驗，觀察用藥后全身狀況及局部皮膚的變化；采用豚鼠進行主動過敏性試驗，觀察紫金透骨噴霧劑是否引起豚鼠皮膚或全身過敏性反應；采用日本大耳白兔進行急性毒性試驗，觀察完整皮膚及破損皮膚多次接受受試藥物所產生的急性毒性反應。結果 紫金透骨噴霧劑對豚鼠和日本大耳白兔完整皮膚無刺激作用，對破損皮膚有輕度可逆的刺激性反應；對豚鼠無皮膚過敏反應；對日本大耳白兔皮膚未見急性毒性反應。結論 紫金透骨噴霧劑皮膚局部用藥安全性良好。

紫金透骨噴霧劑；刺激性；過敏性；急性毒性；安全性

紫金透骨噴霧劑處方源于貴州黔西南州中醫(yī)院經驗方，由紫金蓮、透骨香、白及、松節(jié)油和冰片5味我省地產草藥組成，具有活血散瘀、消腫止痛、舒筋通絡之功效，臨床以酒劑外用于治療跌打損傷、扭傷、關節(jié)腫痛等癥，具有堅實的臨床應用基礎。課題組在充分發(fā)揮我省天然藥物資源優(yōu)勢和繼承傳統(tǒng)中藥特色基礎上，采用現(xiàn)代制劑提取技術富集有效成分，將其研制成了現(xiàn)代中藥噴霧劑，具有方便攜帶、速效、給藥劑量準確、藥物的穩(wěn)定性好等特點。藥理作用研究表明，紫金透骨噴霧劑能明顯減輕軟組織損傷的水腫程度，減少瘀血面積，具有明顯的消炎、鎮(zhèn)痛作用，能一定程度上改善血液流變學，促進局部微循環(huán)，可用于治療急性閉合性軟組織損傷［1-2］。為進一步考察其安全性，參照 《中藥、天然藥物研究技術指導原則》 （2005年版）和相關文獻［3-15］，進行了紫金透骨噴霧劑皮膚刺激性、過敏性和急性毒性研究，并對該藥進行客觀評價，為臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 供試藥 紫金透骨噴霧劑 （貴陽醫(yī)學院貴州省藥物制劑重點實驗室，規(guī)格30 mL/瓶，批號20130318）；2，4-二硝基氯代苯 （上?；瘜W試劑有限公司，批號020711）。

1.2 動物 豚鼠，體質量300～350 g，雌雄兼用，雌性無孕。日本大耳白兔，體質量1.8～2.2 kg，雌雄兼用，雌性無孕。均由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（黔）2002-0001。

1.3 組別及劑量設置

1.3.1 皮膚刺激性試驗 設置高、中、低3個劑量給藥組及對照組。給藥組用藥劑量分別為0.6 g生藥/（kg·d）、0.3 g生藥/（kg·d）、0.15 g生藥/（kg·d）3個劑量。

劑量設置：紫金透骨噴霧劑擬推薦的臨床成人用法用量為，皮膚局部給藥，每日5 mL，成人體質量按60 kg計算，折合0.025 g生藥/（kg·d）。所設劑量相當于成人日用藥劑量的24、12、6倍。

配制方法：本品0.3 g生藥/mL，組間劑量比設置為1∶2。為保證足夠的給藥劑量，高劑量組采取以原藥液2 mL/（kg·次）-1的方式進行。則3個劑量組的配制方法為：高劑量組，原藥液直接使用 （臨床給藥劑量），給藥劑量為0.3 g生藥/mL×2 mL/kg=0.6 g生藥/kg；中劑量組，取原藥液，以75%乙醇 （紫金透骨噴霧劑溶媒）稀釋為1/2使用，給藥劑量為0.3 g生藥/kg；低劑量組，取原藥液，以75%乙醇稀釋為1/4使用，給藥劑量為0.15 g生藥/kg；溶媒對照組為75%乙醇。

1.3.2 皮膚過敏性試驗 設置溶媒對照組 （75%乙醇）、受試物組 （紫金透骨噴霧劑原藥液）、陽性對照組 （1%2，4-二硝基氯代苯溶液）。

1.3.3 急性毒性試驗 設置給藥組 （紫金透骨噴霧劑原藥液）及對照組 （蒸餾水），給藥組用藥劑量為3 g生藥/（kg·d）。

2 方法

2.1 皮膚刺激性試驗［3-8］取豚鼠48只，雌雄各半，于給藥前小心剪盡動物背部左右兩側被毛，去毛區(qū)為4 cm×

4 cm，去毛后24 h，檢查去毛皮膚是否因去毛而劃破，如皮膚受傷，該豚鼠不宜用作完好皮膚的刺激性實驗。將豚鼠分為完整皮膚和破損皮膚受試組，破損皮膚組用滅菌針尖將去毛消毒皮膚劃破，以輕微滲血為度，布滿整個去毛區(qū)。將完整皮膚和破損皮膚組分別分為3個劑量組給藥，每組8只。按各組劑量給藥，對照組與給藥組采用同體左右側自身對比法，均右側涂以藥物，左側涂等量75%乙醇，用藥后用紗布和膠帶覆蓋固定。各組動物均于24 h后去除覆蓋物，用清水洗去殘留受試物。單次給藥組動物僅給予1次；多次給藥組動物每天給藥1次，連續(xù)7 d。單次給藥組動物于去除受試物1、24、48和72 h；多次給藥組動物于每天給藥后24 h、末次給藥后1、24、48和72 h，去除受試物，肉眼觀察并記錄涂藥部位有無紅斑、水腫等反應。結果參照文獻［5-8］進行皮膚刺激反應及刺激強度評分。上述各組動物均在單次或多次給藥試驗結束后，取給藥局部皮膚組織，甲醛固定，HE染色后進行光鏡檢查。

2.2 主動皮膚過敏試驗［3，8-12］取豚鼠24只，雌雄各半，于給藥前24 h小心剪盡動物背部左右兩側被毛，去毛區(qū)為4 cm×4 cm，試驗前隨機分為3組，每組8只：溶媒對照組 （75%乙醇）、紫金透骨噴霧劑受試物組 （原藥液）及陽性對照組 （1%2，4-二硝基氯代苯溶液），每組8只。實驗分兩步進行。

第一步，致敏接觸：各組豚鼠左側去毛皮膚上分別給予0.2 m L受試物溶液，并使其分布均勻。給予藥物后，用紗布和膠帶覆蓋固定，確保使供試品與皮膚接觸6 h，溫水洗去受試藥物。第7天和第14天重復接觸致敏。

第二步，激發(fā)接觸：末次接觸致敏后14 d，在豚鼠右側去毛皮膚上按上法分別涂抹0.2 mL各組供試品激發(fā)接觸，陽性對照藥用0.1%的2，4-二硝基氯代苯溶液，同上法操作。6 h后去除供試品，溫水洗去受試藥物，即刻觀察，并于24、48、72 h再次觀察有無皮膚紅斑、水腫等過敏反應指征。結果參照文獻［8，10-12］進行評價。

2.3 局部皮膚給藥急性毒性試驗［3，9，13-15］取兔24只，雌雄各半，試驗前24 h將動物背部以電剪去毛，去毛面積約為15 cm×10 cm，并隨機分為破損皮膚和完整皮膚兩組。破損皮膚組動物試驗，以75%乙醇消毒脫毛區(qū)皮膚，然后用消毒刀片劃出 “#”型傷口，傷口占滿脫毛區(qū)，深度以皮膚輕度滲血為度，完整皮膚組動物皮膚應保持完好無損。

采用24 h內4次的給藥方式 （每次2.5 mL/kg），受試藥物直接以最大劑量 （原藥液）和最大給藥容積給予 （10 mL/kg，每次分量涂抹防止流淌，保證藥液充分作用于給藥皮膚局部，然后用消毒紗布和網孔尼龍繃帶固定），對照組給予等量蒸餾水，給藥后保證藥液均勻分布于整個去毛區(qū)。給藥前用無菌紗布蘸溫水擦拭皮膚殘留藥物。24 h后溫水擦凈皮膚殘留藥物，觀察1、24、48、72 h直至14 d動物的毒性反應和死亡情況，記錄各組動物的一般生理狀況、行為活動、眼和黏膜的變化、呼吸、中樞神經系統(tǒng)、體質量、進食、大小便等有否中毒表現(xiàn)和死亡情況；觀察涂藥皮膚給藥局部有無紅斑、水腫等反應，參照文獻［5-8］進行皮膚刺激反應及刺激強度評分。試驗結束后將動物處死進行大體解剖學檢查。

3 結果

3.1 皮膚刺激性試驗 實驗結果表明單次、多次給紫金透骨噴霧劑后，完整皮膚各劑量組評分均為 “0”；對破損皮膚，3個劑量平均反應分值在1 h均大于0.5，但低于2.99，表明本品對破損皮膚有輕度刺激性。單次給藥后24 h后，刺激性明顯消退，平均反應分值均小于0.5，各劑量組給藥后48 h刺激性消失，觀察結果見表1。多次給藥后24 h后，中、低劑量組刺激性明顯消退，平均反應分值均小于0.5，各劑量組給藥后48 h刺激性消失。觀察結果見表2。溶媒對照組均未表現(xiàn)出刺激性。

3.2 主動皮膚過敏試驗 紫金透骨噴霧劑及溶媒對照組豚鼠激發(fā)接觸72 h內觀察，皮膚無紅斑及水腫現(xiàn)象出現(xiàn)，其反應級數(shù)平均值為0，致敏率均為0；陽性對照組紅斑、水腫和致敏率在72 h內表現(xiàn)為不同級別反應指征。結果見表3。

3.3 局部皮膚給藥急性毒性試驗 觀察14 d內動物死亡情況和全身中毒表現(xiàn)。試驗期內無一動物死亡，觀察發(fā)現(xiàn)各給藥組動物無異常表現(xiàn)［13］；紫金透骨噴霧劑最大耐受量給藥皮膚刺激反應試驗中，完整皮膚各劑量組評分均為“0”，破損皮膚的平均反應分值在1 h內表現(xiàn)出中度刺激性，給藥后24 h后，刺激性明顯消退，表現(xiàn)為輕度刺激性，72 h后刺激性完全消失。溶媒對照組均未表現(xiàn)出刺激性。結果見表4～6。

表1 單次給藥皮膚刺激反應實驗評分結果 （n=8）

表2 多次皮膚刺激反應實驗評分結果 （n=8）

表3 皮膚過敏實驗評分結果 （n=8）

表4 完整皮膚最大耐受量給藥體質量及死亡情況 （n=3）

表5 破損皮膚最大耐受量給藥體質量及死亡情況 （n=3）

表6 最大耐受量給藥皮膚刺激反應試驗評分結果 （n=3）

4 討論

本實驗均參照 《中藥、天然藥物研究技術指導原則》和相關文獻［3-9］進行，結果證實紫金透骨噴霧劑對豚鼠和日本大耳白兔完整皮膚無刺激性、對破損皮膚有可逆的輕微刺激性作用，對豚鼠無皮膚過敏反應。在局部給藥急性毒性預試驗時，為保證足夠的受試劑量，紫金透骨噴霧劑已達到最大劑量和給藥容積，故預試驗中未測出LD50，僅以最大給藥量3 g生藥/（kg·d）-1進行試驗測定，相當于臨床日用量的120倍，這提示本品毒性較低；并且通過觀察動物短期內接觸本品，亦可見其無皮膚急性毒性。說明紫金透骨噴霧劑是一種安全性較高的外用制劑，臨床用于治療氣滯血瘀型急性閉合性軟組織損傷，局部腫脹、刺痛，關節(jié)活動受限等癥是安全的。

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R285.5

B

1001-1528（2015）12-2749-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.038

2015-01-12

貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目 （黔科合中藥字 ［2013］5062號；黔科合重G字 ［2013］4001）；貴州省高等學校創(chuàng)新能力提升計劃 （黔教合協(xié)同創(chuàng)新字 ［2013］04）

羅媛 （1982—），女，碩士生，研究方向為中藥藥代動力學、活性物質基礎與藥物新劑型

*通信作者：黃 勇 （1976—），男，教授，研究方向為中藥活性物質基礎及藥動學研究與藥物新劑型、新技術。Tel：（0851）6908468，E-mail：mailofhy@126.com