張靜，范娟

（黑龍江省蠶業(yè)研究所，哈爾濱 150086）

擬南芥和小菜蛾相互作用的差異蛋白分析

張靜，范娟

（黑龍江省蠶業(yè)研究所，哈爾濱 150086）

以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和專食性害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）為研究系統(tǒng)，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了擬南芥在小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下葉片蛋白的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明：有52個(gè)蛋白點(diǎn)在小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下發(fā)生顯著變化，其中28個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，24個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)。運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對其中的部分差異蛋白進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白，3-磷酸甘油醛脫氫酶，ATP合酶的α亞基和β亞基在植物誘導(dǎo)防御中具有重要的作用，為揭示植物在昆蟲取食條件下的化學(xué)防御機(jī)制提供蛋白質(zhì)水平方面的理論基礎(chǔ)。

小菜蛾；擬南芥；雙向電泳；質(zhì)譜；誘導(dǎo)防御

植物在漫長的進(jìn)化過程中形成了重要的防御機(jī)制，而昆蟲取食誘導(dǎo)的防御機(jī)制是植物防御植食者保護(hù)自身的主要機(jī)制[1]。在昆蟲取食誘導(dǎo)條件下的植物機(jī)體自身可以合成次生代謝物質(zhì)來達(dá)到防御目的。誘導(dǎo)產(chǎn)生的物質(zhì)有萜類、煙堿和酚類等次生化學(xué)物質(zhì)，使植物增強(qiáng)抗性[2]。昆蟲取食也可誘導(dǎo)相關(guān)抗蟲基因的表達(dá)，引起一系列防御蛋白發(fā)生變化。鑒于此，研究昆蟲取食誘導(dǎo)植物的抗蟲性，既要研究相關(guān)抗蟲基因，還要對蟲害應(yīng)答蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行探究。

小菜蛾（Plutella xylostella）是專食性昆蟲（specialist），咀嚼式口器，以植物的葉片為食，是十字花科植物最重要的害蟲之一[3]。小菜蛾是世界性破壞性害蟲，其寄主多達(dá)40種以上，年發(fā)生的世代多，繁殖系數(shù)較高，且世代重疊的現(xiàn)象嚴(yán)重，最早發(fā)生于地中海地區(qū)，后來在我國熱帶地區(qū)的危害尤為猖獗，北方地區(qū)也呈加重趨勢。以幼蟲取食葉片，嚴(yán)重時(shí)葉片被食成網(wǎng)狀，降低食用價(jià)值，影響經(jīng)濟(jì)效益。擬南芥是一種十字花科植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物，該植物具有個(gè)體小、生長周期快、形態(tài)特征簡單、生命力強(qiáng)、基因組小等優(yōu)點(diǎn)。研究表明擬南芥是

植物誘導(dǎo)防御機(jī)制研究的模式材料，其與小菜蛾互作系統(tǒng)被證明是研究植物和昆蟲相互作用的可靠模型[4]。

研究以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和專食性害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）為植物與昆蟲互作體系，運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，解析相關(guān)蟲害應(yīng)答蛋白的功能，為利用植物自身防御體系實(shí)現(xiàn)有效控制農(nóng)業(yè)害蟲提供理論方面的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

擬南芥（Arabidopsis thanliana，Col-0）養(yǎng)植方法：在MS培養(yǎng)基中對種子進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)芽后一周將幼苗轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土和蛭石（比例約為2∶1）中，培養(yǎng)3周，溫度為白天22℃，夜晚20℃，光強(qiáng)度80 μE·s-1·m-2，相對濕度為75%，光暗比為16 L∶8 D。

小菜蛾的飼養(yǎng)是以白菜幼苗喂食，3齡幼蟲作為供試?yán)ハx。一頭幼蟲放在一株擬南芥葉片上進(jìn)行取食，8 h后，移除幼蟲收集擬南芥植株的樣品[5]。

空白對照組：用MilliQ級純水噴灑擬南芥植株，8 h后收集植株。

樣品收集是幼蟲取食后，移除幼蟲剩下的全部植株葉片作為一個(gè)樣品，三次重復(fù)。

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

樣品蛋白質(zhì)的提取運(yùn)用飽和酚抽提法[6]。蛋白質(zhì)裂解液為（7 M尿素，2 M硫脲，2%IPG Buffer，2% CHAPS，2%SB3－10，20 mM DTT，5 mM TCEP，0.002%溴酚藍(lán)）。采用Bradford法測定蛋白濃度[7]。

1.3 雙向電泳

1.3.1 等電聚焦（IEF）

試驗(yàn)所用儀器為Ettan DALT雙向電泳儀。蛋白質(zhì)的上樣量為300 μg，將蛋白質(zhì)樣液連續(xù)的加入在水化槽中。剝開固相pH梯度（IPG）膠條（pH 4-7）保護(hù)膜后，膠面朝下放入水化槽中（礦物油覆蓋），室溫水化16 h，然后進(jìn)行等電聚焦[8]。

1.3.2 膠條的平衡

第一向等電聚焦結(jié)束后進(jìn)行IPG膠條的平衡，IPG膠條分別在平衡液Ⅰ和Ⅱ中平衡15 min[9]，然后進(jìn)行垂直電泳。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

膠條平衡后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為12.5%，恒流電泳到凝膠前沿約0.5 cm時(shí)終止。試驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.4 銀染及凝膠圖像分析

蛋白凝膠染色方法根據(jù)Blum等[10]的報(bào)道，利用ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件分析，步驟按照差異蛋白點(diǎn)檢測、凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理、蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì)進(jìn)行。制備膠用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行染色。1.3.5差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

從制備膠上切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，酶解采用Hughes等[11]報(bào)道的方法進(jìn)行，利用胰蛋白酶進(jìn)行酶解。利用4700型MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白鑒定，具體參照Zhang等[12]報(bào)道的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥蛋白（小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下）雙向電泳

通過ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件分析，在蛋白凝膠上，重復(fù)性較好，平均有652個(gè)蛋白點(diǎn)（圖1）。

圖1 小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下擬南芥葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜Fig.1Proteomic 2-DE maps of Arabidopsis thaliana under the induced leaf of Plutella xylostella

通過軟件對凝膠圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在小菜蛾取食擬南芥的處理組中蛋白與對照相比具有顯著性的差異，以蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化在3倍以上為檢測閾值，結(jié)果有52個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生了變化，其中有28個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，24個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)，如圖1所示，代表性差異蛋白點(diǎn)見圖2。

圖2 不同處理?xiàng)l件下擬南芥蛋白點(diǎn)的豐度變化Fig.2Abundance changes of Arabidopsis thanliana protein spots under different stress

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

通過軟件分析不同處理?xiàng)l件下雙向電泳圖譜的匹配情況，運(yùn)用MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)對部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了檢測，采用Matrix science網(wǎng)站提供的Mascot檢索程序進(jìn)行檢索，分析數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 擬南芥在小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下差異蛋白的質(zhì)譜鑒定Table 1Identification of the differentially expressed proteins in Arabidopsis under the induced leaf of Plutella xylostella

通過質(zhì)譜鑒定得到的蟲害應(yīng)答蛋白包括：核酮糖二磷酸羧化酶（Ribulose bisphosphate carboxylase，Spot 20）、富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白8（Glycinerich RNA-binding protein 8，Spot 22）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Spot 31）、CBL互作蛋白激酶6（CBL-interacting protein kinases 6，Spot 41）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基（ADP-Glucose pyrophosphorylase small subunit，Spot 45）、ATP合酶beta亞基（ATP synthase subunit beta，Spot 46 and Spot 47）和ATP合酶alpha亞基（ATP synthase subunit alpha，Spot 48）。

3 討論與結(jié)論

隨著擬南芥等模式植物基因組序列測定工作的完成，為蛋白功能的探究創(chuàng)造了條件。植物對昆蟲取食應(yīng)答不僅在基因水平上發(fā)生變化，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面也有一定的影響變化。差異蛋白質(zhì)組一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)，其核心在于找到引起不同樣本之間蛋白質(zhì)組差異的影響因子，揭開和證明蛋白質(zhì)組的變化[13]。試驗(yàn)中，在小菜蛾取食誘導(dǎo)條件下有52個(gè)表達(dá)發(fā)生明顯變化的蛋白點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了我們預(yù)期的結(jié)果。在昆蟲取食條件下，擬南芥的蛋白質(zhì)表達(dá)情況不僅是數(shù)量和種類的變化，其基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)性存在著一定的復(fù)雜性。原因是不同的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)和所具有的特性都有很大的差別，這種差別體現(xiàn)在量的變化、合成和降解的速度以及翻譯后的修飾等[14]。

富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白（表達(dá)量下調(diào)）是植物中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，具有C末端的RNA識別基序（RNA-recognition motifs，RRM），以及N末端的甘氨酸富集區(qū)域。研究表明RNA結(jié)合活性所必需的為C末端的甘氨酸富集區(qū)域[15]。有報(bào)道機(jī)械損傷等處理?xiàng)l件下的植物，體內(nèi)編碼GRP基因的mRNA含量增加，脅迫的條件下GRP的含量變化尤其顯著，會(huì)迅速積累到很高的水平，提高植物應(yīng)對脅迫的能力[16]。GRP基因的表達(dá)有利于木質(zhì)素的形成，使植物細(xì)胞壁相關(guān)結(jié)構(gòu)增厚，植物木質(zhì)素的形成有利于對逆境的適應(yīng)，增強(qiáng)植物的抗蟲性[17]。

3-磷酸甘油醛脫氫酶（表達(dá)量上調(diào)）是高等植物卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，在糖酵解過程中發(fā)揮的作用尤其重要[18]。GAPDH基因是一種重要的抗逆脅迫基因，在機(jī)體應(yīng)答傷害信號時(shí)發(fā)揮顯著作用[19]，植物在面對害蟲取食誘導(dǎo)后，體內(nèi)的GAPDH基因通過翻譯調(diào)控來改變機(jī)體的代謝平衡進(jìn)行防御[20]。在小菜蛾取食擬南芥后，植物GAPDH蛋白表達(dá)量發(fā)生了顯著的變化，可以推斷3-磷酸甘油醛脫氫酶在擬南芥的誘導(dǎo)防御反應(yīng)中起著重要的作用，具體的調(diào)控機(jī)制有待于探究。

ATP合酶（表達(dá)量上調(diào)）又稱H+-ATP酶或F1F0-ATP酶，是參與能量代謝的關(guān)鍵酶，廣泛存在于葉綠體和線粒體中，是光合作用不可缺少的重要酶類。ATP合酶的β亞基為其催化亞基，參與呼吸鏈的電子傳遞。研究報(bào)道紅樹在鹽脅迫的情況下ATP合酶β亞基的表達(dá)量增加，光合作用的增強(qiáng)，促進(jìn)紅樹耐鹽的能力提高[21]。在小菜蛾取食脅迫下，體內(nèi)的ATP合酶β亞基的表達(dá)量增加，我們推測植物光合作用

的強(qiáng)度也在不同程度上發(fā)生改變，在受到外界傷害后需要啟動(dòng)各種防御反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體，而這些反應(yīng)的過程需要消耗額外的能量來應(yīng)對昆蟲的取食。

在昆蟲取食誘導(dǎo)條件下，與三羧酸循環(huán)相關(guān)的核酮糖二磷酸羧化酶（Spot 20）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（Spot 31）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基（Spot 45）發(fā)生了顯著的變化。研究表明，煙草在專食性與多食性害蟲取食24 h后，植株的光和速率顯著下降[22]?？梢酝茢啵夂献饔门c植物防御之間這種負(fù)相關(guān)可能與植物能量分配有關(guān)，即植物機(jī)體合成的能量有一部分應(yīng)用于防御反應(yīng)的能量消耗[23]，當(dāng)植物遭受昆蟲為害時(shí)，體內(nèi)進(jìn)行能量資源的再分配以防御昆蟲的取食。植物對昆蟲的取食響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，通過植物和昆蟲互作模型的建立，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)一些昆蟲取食應(yīng)答蛋白，為解析昆蟲取食條件下植物誘導(dǎo)防御機(jī)制，開拓害蟲防治的新思路具有重要的指導(dǎo)意義。

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Analysis of Differential Proteins on Interaction between Arabidopsis thaliana and Plutella xylostella

Zhang Jing，F(xiàn)an Juan
（Sericulture Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150086）

The differential expressed proteins of Arabidopsis thaliana that fed by the special diets insect Plutella xylostella compared with the normal growth were analyzed by use of the two dimensional electrophoresis.The results of the intensities of 52 protein spots in more than 650 spots were detected on each 2D gel changed significantly by using Image MasterTM2D platinum 6.0 software. Among them，28 protein spots were up-regulated，and 24 spots were down-regulated under the insect feeding for 8 h.Some proteins were identified by MALDI-TOF-TOF MS successfully，such as the Glycine-rich RNA-binding protein，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，ATP synthase α and β subunits.These proteins might have played an important role in the process，and the further analysis study of the different proteins could offere the theoretical foundation to reveal the plant defense mechanism.

Plutella xylostella；Arabidopsis thaliana；2-DE；mass spectrometry；induced-defense

S433

A

1002-2090（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.001

2014-05-26

張靜（1984-），女，吉林大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事蜂業(yè)研究方面的工作。