廣東省從化市婦幼保健院(510900)羅巧靈

大型生長激素(PRL)型垂體腺瘤是一種較為常見的激素分泌性垂體瘤［1］，在此類型中所占的比重約為35%～45%［2］，PRL垂體腺瘤種類中的侵襲性腺瘤具有全切率低、復發(fā)率高的特點［3］，成為臨床治療的難點。但是經(jīng)過醫(yī)療科學人員的不懈努力，終于研制出了對抗PRL垂體腺瘤的方式，但是在目前醫(yī)療技術水平條件的制約下，手術、放療、藥物等治療措施仍很難將其徹底根治。經(jīng)過體外實驗研究表明，垂體腫瘤細胞轉化基因(PTTG)成為了垂體腺瘤靶向治療的重要基因之一，近年來成為垂體腺瘤基礎研究的熱點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂體腺瘤細胞生長的體外實驗需要的材料有:培養(yǎng)基、FBS［4］、瓊脂糖、綠色熒光蛋白重組載體、pHelper3.0包裝系統(tǒng)、LV-NC病毒載體、兔抗鼠PTTG抗體、羊抗兔IgG、預染蛋白、PVDF膜、顯色劑、MTT、1.5mlEP管，20～250μL移液器。其中FBS胎牛血清、瓊脂糖、羊抗兔IgG、預染蛋白、PVDF膜、顯色劑均為國外進口。

1.2 原代培養(yǎng)源 原代培養(yǎng)源主要由從化的1位PRL型垂體腺腫瘤的患者提供，男，年齡42歲，通過手術切除腫瘤標本。對得到的腫瘤標本按照規(guī)定進行原代培養(yǎng)試驗。

1.3 PTTG-shRNA慢病毒載體的構建 利用short interfering RNA設計工具軟件進行設計，合并具有shRNA結構的短發(fā)夾序列。干擾序列為5'-aaTACACCTAGTTAACCGACTTGCCAtt-3'，寡核苷酸序列有:1)正義鏈為5'-CCGAAGTTGAATAGCCTCAGCAGAGCGATCGAGCTTTT-3'。2)反義鏈為5'-AATGACTAAAATGCGTACATAAGTCGAGTACGCTTAGC AG-3'。

正義鏈與反義鏈中均含有酶切位點，形成雙鏈DNA，與酶結合、轉化鏈接，生成pGCSIL-GFD重組載體，聯(lián)合pHelper3.0質粒后共傳染了300T細胞，產(chǎn)生PTTG-shRNA慢病毒載體，病毒載體滴度為4×109TU/mL。

1.4 實驗分組以及慢病毒傳染的情況 傳染前1天將細胞接種在孔板上，分為正常對照組、陰性對照組和觀察組。正常對照組不進行任何處理，對陰性對照組進行慢病毒載體傳染，觀察組進行PTTG-shRNA進行傳染。

2 結果

2.1 PTTG-shRNA慢病毒感染的效果 經(jīng)過慢病毒感染后的細胞在5小時后有綠色熒光現(xiàn)象產(chǎn)生，71小時后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)進行為期2天的培養(yǎng)，流式細胞儀分析后，3組腫瘤細胞的表達率均符合實驗的需求。

2.2 3組PTTG基因表達情況 觀察組PTTG基因表達為(0.27±0.03)，正常對照組PTTG基因表達為(0.94±0.04)，陰性對照組PTTG基因表達為(0.96±0.06)，基因表達量明顯下降，P＜0.05，差異具有顯著性。

2.3 3組PTTG蛋白表達情況 觀察組PTTG蛋白的表達量為(0.13±0.04)，正常對照組PTTG蛋白的表達量為(0.94±0.06)，陰性對照組PTTG蛋白的表達量為(0.87±0.06)。

2.4 3組傳染后細胞生長情況比較 傳染71小時后，觀察組細胞的生長發(fā)育能力、轉移擴散能力明顯降低，比其他兩組抑制細胞生長的能力更強，并且再經(jīng)24小時后繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，此結論表現(xiàn)的更為明顯。陰性對照組與正常對照組則沒有發(fā)生癌細胞生長方面情況的變化。

2.5 3組細胞凋亡需要的周期 觀察組的垂體腫瘤細胞G0/G1時期細胞凋亡的情況明顯，但是在S時期出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，從總體上來說給垂體腫瘤患者帶來了福音。

2.6 提供垂體腺腫瘤的患者護理情況 從化市提供垂體腺腫瘤的患者經(jīng)過精心護理后病情得到了較大的好轉。術后對患者提供的護理服務有:1)蘇醒后的護理方式。在患者蘇醒6個小時后需要給床海拔16頭，防止靜脈回流造成腦部水腫。2)膨脹海綿塞住患者的口腔。在手術24小時后對患者進行鼻腔護理和口腔護理，患者沒有發(fā)生感染的情況。3)并發(fā)癥的護理。對于手術后患者高熱的不良反應，本次護理中給患者使用了冬眠藥物，有效地避免了意識障礙情況的發(fā)生。

3 討論

PTTG是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的原癌基因，在垂體腺瘤靶向治療中具有極大的潛在價值。從關于人PRL型垂體腺瘤的相關研究中發(fā)現(xiàn)，PPTG是一種能夠促進癌癥細胞生長、擴散，提高吞噬能力的癌癥基因［6］，能夠使腫瘤周邊產(chǎn)生新的血管，加快腫瘤細胞的繁殖速度。裸鼠試驗證明，在沒有其他癌癥基因的前提下，PTTG也能夠導致裸鼠快速致癌［7］。

通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，PTTG基因的突變能夠消除其對正常細胞的惡性影響［8］，具有抑制人PRL型垂體腺瘤細胞擴散的作用，成為生物治療重點研究的課題，是當今醫(yī)學界最為熱門的靶點之一［9］。

本次研究中，利用了shRNA技術進行干擾，下調(diào)PTTG基因中蛋白的表達，設立正常對照組和陰性對照組，觀察經(jīng)過干預后癌細胞增殖和凋亡的情況，系統(tǒng)地分析慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂體腺瘤細胞生長的作用。結果表明，PTTG病毒載體對垂體細胞的傳染可高達97%以上，且觀察組PPTGmRNA表達比正常對照組和陰性對照組更趨于正常狀況，下降較為明顯。另外，觀察組腫瘤細胞的生長能力出現(xiàn)滑坡的趨勢，對垂體腫瘤細胞的抑制效果更為明顯，凋亡率顯著提高。但是，PPTG誘導腫瘤細胞死亡的原理目前并不是非常明確，需要進一步進行求證。

由實際病例的護理方式得到了良好的效果和上述實驗中的啟示，可以得知在護理中需要注重的問題。1)嚴密檢測病情的發(fā)展情況。密切注重PTTG蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)異常情況立刻采取相關的措施控制病情。2)在做好基本護理的同時需要對患者進行心理疏導。在患者得知自己的病情經(jīng)過手術、放療、藥物等治療措施仍很難將其徹底根治這一基本情況時，會產(chǎn)生恐懼、憂慮的心理，因此需要對患者進行心理干預，減少不良的心理狀態(tài)對患者的影響，幫助患者用積極的心態(tài)迎接病魔的挑戰(zhàn)。

綜上所述，慢病毒介導的shRNA沉默PTTG能夠抑制人PRL型垂體腺瘤細胞的生長，消除PTTG基因的惡性影響［10］，抑制癌細胞的擴散，降低PPTGmRNA和蛋白表達水平，提高癌癥細胞的凋亡率，為垂體腺瘤的生物治療探索有效的治療途徑，具有極強的醫(yī)學價值，值得推廣。

［1］沈云龍，崔玉婷，朱劍峰，等.慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因表達對人生長激素型垂體腺瘤細胞生長的影響［J］.中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2012，8:376

［2］沈云龍，崔玉婷，朱建峰，等.PTTG基因siRNA載體的構建與鑒定［J］.解剖學研究，2012，4:280

［3］范勝強.RNAi沉默PTTG對大鼠垂體腺瘤細胞CD147、MMP-9表達的影響［D］.山東大學，2012

［4］曹中喆.PI3K/Akt/mTOR及其下游通路在PRL垂體腺瘤中的表達及意義［D］.河北醫(yī)科大學，2013

［5］蔡鋒.TGFβ1/Smad-SDF-1α/CXCR4在成纖維細胞-垂體腺瘤細胞相互作用中的機制研究［D］.北京協(xié)和醫(yī)學院，2013

［6］莫小亮.HPV16E6和hTERT在宮頸癌致癌機制中的作用研究［D］.廣西醫(yī)科大學，2014

［7］孫帥奇.100例垂體腺瘤患者的臨床回顧分析［D］.桂林醫(yī)學院，2013

［8］李妍，杜紅延，李紅衛(wèi).慢病毒載體及其在RNA干擾技術中的應用與發(fā)展［J］.分子診斷與治療雜志，2013，1:55

［9］陳其鉆，陳謙學.垂體腺瘤治療現(xiàn)狀和進展［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2013，6:381

［10］彭冬先，何援利，丘立文.慢病毒介導靶向survivin基因的shRNA對裸鼠子宮內(nèi)膜異位病灶生長的影響［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2013，9:704