歐陽偉煒 李卓玲 蘇勝發(fā) 盧 冰

肺癌是發(fā)生率和病死率增長最快，對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。隨著手術(shù)方式、放療技術(shù)的改進(jìn)，化療方案的日趨成熟，基因、生物治療的開展，使肺癌的綜合治療達(dá)到了一個(gè)新的水平。但是肺癌患者在原發(fā)腫瘤切除后仍出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其總的5 年生存率沒有明顯提高［1］。近年來，許多研究者認(rèn)為肺癌微轉(zhuǎn)移是引起腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移對(duì)非小細(xì)胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) 更精確的分子分期、制定綜合的治療方案、預(yù)后判斷提供依據(jù)［2］。肺癌微轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤發(fā)展過程中，播散并存在于血液循環(huán)、淋巴道、骨髓及各組織器官中的腫瘤細(xì)胞，尚未形成轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，且無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)病理學(xué)、普通影像學(xué)等方法難以發(fā)現(xiàn)和檢測到的轉(zhuǎn)移。目前檢測微轉(zhuǎn)移的方法有很多，包括HE 連續(xù)切片法、免疫組織化學(xué)法( immunohistochemistry，IHC) 、聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)( polymerase chain reactions，PCR) 技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、PET-CT 檢查等方法。本文主要對(duì)近年P(guān)CR 技術(shù)在肺癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

一、PCR 技術(shù)概念

PCR 技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，PCR 種類包括PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR、反向PCR、不對(duì)稱PCR、多重PCR、巢式PCR、遞減PCR。PCR 技術(shù)的影響因素很多，包括模板、引物、循環(huán)溫度、循環(huán)次數(shù)、反轉(zhuǎn)錄酶、鎂離子濃度、RNA 酶被污染等，在實(shí)驗(yàn)中要特別注意這些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。目前肺癌微轉(zhuǎn)移主要應(yīng)用3 種技術(shù)，以下對(duì)這3 種技術(shù)進(jìn)行說明。

1.PCR：PCR 是選擇性的體外快速擴(kuò)增DNA 或RNA 片段的方法，以母鏈DNA 為模板，在DNA 聚合酶的催化下，以特定引物為延伸點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟復(fù)制出與母鏈DNA 互補(bǔ)的子鏈DNA 的過程。PCR 是一項(xiàng)DNA 體外合成放大技術(shù)，它能在數(shù)小時(shí)內(nèi)將目的基因片段擴(kuò)增106～8倍。PCR 技術(shù)常用于檢測腫瘤細(xì)胞中的基因突變、染色體重排等DNA 異常。Kishimoto 等［3］用PCR -SSCP 法檢測了115 例NSCLC 手術(shù)切除后常規(guī)病理檢查無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的p53 突變，結(jié)果顯示52% p53 基因突變陽性，提示有NSCLC 微轉(zhuǎn)移的存在。

2.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)( reverse transcriptase polymerase chain reactions，RT -PCR) ： RT -PCR 是以RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。通過檢測待檢組織中的腫瘤標(biāo)志物mRNA 來證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在，敏感度可以大大提高，目前是公認(rèn)診斷NSCLC 微轉(zhuǎn)移最常用、最敏感的方法。Jiang 等［4］對(duì)有胸腔積液的肺癌患者通過RT -PCR 技術(shù)，檢測甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1( thyroid transcription factor 1，TTF -1) mRNA，發(fā)現(xiàn)TTF -1 mRNA 可以作為肺癌胸膜微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，能診斷合并胸腔積液的肺癌，特別是原發(fā)性肺腺癌。

3. 熒光定量PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q - PCR ) ： FQ - PCR 是 在RT-PCR 反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針，該探針能與擴(kuò)增基因的某一區(qū)域的序列發(fā)生特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和自動(dòng)定量，因而FQPCR 又稱實(shí)時(shí)定量PCR( real time quantitative，PCR)或反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR( real -time RT -PCR 或quantitative real-time RT-PCR) ，亦有人稱為QPCR( quantitative PCR) 或RT - QPCR( reverse transcriptase -quantitative polymerase chain reactions) 。Saintigny等［5］應(yīng)用real-time RT-PCR 技術(shù)，以細(xì)胞角蛋白7( cytokeratin 7，CK7) 、CK19、黏蛋白1( mucin type 1，MUC1) mRNA 檢測19 例NSCLC 患者，29 例健康人，17 例肺部良性疾病患者。19 例NSCLC 中4 例明確有NSCLC 微轉(zhuǎn)移，6 例明確有NSCLC 轉(zhuǎn)移及19 例NSCLC 中有84 枚常規(guī)病理陰性淋巴結(jié)。健康人及肺良性疾病CK19、CK7、MUC1 均為陰性，4 例NSCLC微轉(zhuǎn)移及6 例NSCLC 明確轉(zhuǎn)移至少能檢測出上述標(biāo)志物中的一個(gè)陽性，84 枚常規(guī)病理陰性淋巴結(jié)7%至少能檢測出上述標(biāo)志物中的一個(gè)陽性，預(yù)后評(píng)估待進(jìn)一步隨訪研究。Saintigny 等還指出 CK19 及CK7mRNA 有很高的敏感度，認(rèn)為是檢測肺癌淋巴結(jié)及骨髓微轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)，但是CK19 特異性較低。Song 等［6］認(rèn)為檢測出CK19 mRNA 與肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)。

二、PCR 技術(shù)在肺癌微轉(zhuǎn)移檢測中應(yīng)用的意義

1.提高診斷的準(zhǔn)確性：肺癌患者微轉(zhuǎn)移病灶的檢測，可以補(bǔ)充病理的TNM 分期，精確到分子生物學(xué)分期，能提高診斷的準(zhǔn)確性。Yarbro［7］提到NSCLC 患者外科手術(shù)后病理TNM 分期是分期的金標(biāo)準(zhǔn)，可以作為一個(gè)重要的預(yù)后因素。Perng 等［8］提到雖然多數(shù)研究者認(rèn)為手術(shù)的病理分期是診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但是該研究者卻認(rèn)為病理學(xué)的TNM 分期不能令人完全滿意，不能準(zhǔn)確的評(píng)估生存率。Qiu 等［9］對(duì)早期NSCLC根治術(shù)后病理學(xué)陰性淋巴結(jié)應(yīng)用FQ-PCR 技術(shù)檢測癌胚抗原( carcino - embryonic antigen，CEA) mRNA，IHC 檢測p53、AE1/AE3。發(fā)現(xiàn)FQ-PCR 檢測193 枚病理學(xué)陰性淋巴結(jié)有32 枚( 16.6%) CEA mRNA 陽性表達(dá)。應(yīng)用FQ -PCR 技術(shù)檢測CEA mRNA 的表達(dá)能檢測ⅠNO期病理學(xué)陰性淋巴結(jié)的NSCLC 患者的微轉(zhuǎn)移。CEA mRNA、p53、AE1/AE3 陽性者無病生存期明顯低于陰性者。該研究表明早期NSCLC CEA mRNA、p53、AE1/AE3 的聯(lián)合檢測可以提高準(zhǔn)確的N 分期，提高診斷的準(zhǔn)確性，能提供重要的預(yù)后信息。Ⅰ期NSCLC 微轉(zhuǎn)移通過FQ -PCR 的檢測比IHC 敏感。前哨淋巴結(jié)( sentinel lymph node，SLN) 是原發(fā)腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)中的特殊淋巴結(jié)，是原發(fā)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第1 站淋巴結(jié)，及早檢測SLN 能明確患者分期、指導(dǎo)治療、評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Melfi 等［10］通過RT-PCR 技術(shù)檢測16 例患者前哨淋巴結(jié)CK19 和CK7 檢測出6 例出現(xiàn)肺癌微轉(zhuǎn)移。有1 例病理檢測肺癌微轉(zhuǎn)移陰性的患者用RT -PCR 檢測出肺癌微轉(zhuǎn)移，該例患者在手術(shù)后3 個(gè)月出現(xiàn)復(fù)發(fā)。SLN 用RT-PCR 能提高NO期的肺癌微轉(zhuǎn)移檢出率，能提高診斷的準(zhǔn)確性。

有研究認(rèn)為DVL -3 和δ -catenin 在肺癌中能異常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)移［11，12］。Li 等［13］應(yīng)用RT - PCR技術(shù)，檢測75 例有胸腔積液的肺癌患者和51 例有胸腔積液的肺部良性疾病患者的DVL-3 mRNA 和δcatenin mRNA，結(jié)果顯示對(duì)比良性疾病DVL -3 mRNA 和δ -catenin mRNA 在惡性病變有顯著增高，特別是在肺腺癌中呈高表達(dá)。DVL -3 mRNA 在肺癌中有很高的特異性( 94. 1%) ，陽性預(yù)測值( positive predictive value，PPV) 高達(dá)95.7%，δ -catenin mRNA有很高的敏感度(92.0%) ，陰性預(yù)測值( negative predictive value，NPV) 達(dá)到88.5%。當(dāng)兩者聯(lián)合評(píng)價(jià)時(shí)敏感度 100.0%，NPV 為 100.0%，準(zhǔn)確度為96.0%。DVL-3 mRNA 和δ-catenin mRNA 能作為胸膜微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，能診斷有胸腔積液肺癌患者的微轉(zhuǎn)移。Li 等［14］收集44 例Ⅰ期NSCLC 患者的原發(fā)腫瘤及病理學(xué)陰性淋巴結(jié)，應(yīng)用RT -PCR 技術(shù)檢測surviving mRNA 和livin mRNA，發(fā)現(xiàn)surviving mRNA 在44 例原發(fā)腫瘤中均表達(dá)，livin mRNA 在44例原發(fā)腫瘤中有39 例表達(dá)，livin mRNA 和( 或) surviving mRNA 陽性表達(dá)的Ⅰ期NSCLC 患者15 例(34.1%) 存在NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。RT -PCR 技術(shù)檢測surviving mRNA 和livin mRNA 陽性表達(dá)者較陰性表達(dá)者有很高的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤相關(guān)死亡，無病生存率和總生存率明顯下降。surviving mRNA 和livin mRNA 能作為分子診斷標(biāo)志物用于檢測Ⅰ期NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，提高診斷NSCLC 微轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性。

Oddmund 等［15］應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)表面活性蛋白C( surfactant protein C，SFTPC) 在正常淋巴結(jié)不表達(dá)，在NSCLC 腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)高表達(dá)。CK19 mRNA 在NSCLC 腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)對(duì)比正常淋巴結(jié)呈高表達(dá)，SFTPC 和CK19 mRNA 是檢測NSCLC 局部淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Mohajeri 等［16］應(yīng)用PCR 技術(shù)和IHC 對(duì)41 例NSCLC 患者進(jìn)行骨髓微轉(zhuǎn)移檢測。PCR 技術(shù)檢測出14 例( 34%) 陽性，IHC檢測出2 例(4.8%) 陽性，表明PCR 能作為肺癌骨髓微轉(zhuǎn)移檢測的方法，PCR 技術(shù)比IHC 更能提高診斷的準(zhǔn)確性。EGFR( the epidermal growth factor receptor) 是上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，在NSCLC 患者中過度表達(dá)。Zhang 等［17］應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測42 例NSCLC 患者和對(duì)照組40 例健康人的外周血的EGFR 的mRNA 表達(dá)水平，EGFR mRNA 的陽性率患者占69%，健康人占12.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0.05) 。結(jié)果表明外周血的EGFR mRNA表達(dá)水平能診斷NSCLC 微轉(zhuǎn)移，有重要的臨床價(jià)值，能了解肺癌的預(yù)后。外科操作可以促進(jìn)血液轉(zhuǎn)移，Song 等［6］應(yīng)用FQ-RT-PCR 技術(shù)檢測30 例NSCLC肺切除術(shù)的患者CD44v6 mRNA，CD44v6 基因在NSCLC 患者靜脈血的表達(dá)明顯高于健康者。CD44v6基因表達(dá)在肺切除術(shù)的晚期明顯高于早期。VEGFA、VEGF -C、VEGF -D、VEGF -3 是促進(jìn)實(shí)體腫瘤淋巴管生成的重要信號(hào)，通過這些淋巴結(jié)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。Nwogu 等［18］應(yīng)用RT - PCR 對(duì)NSCLC 患者檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF-A、VEGF -C、VEGF -D、VEGF 受體-3 在高表達(dá)的淋巴結(jié)中存在微轉(zhuǎn)移。NSCLC 微轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)的VEGF-A/C/D 或VEGF-受體-3 表達(dá)水平有相關(guān)性。

2.指導(dǎo)治療： 肺癌患者通過PCR 技術(shù)能檢測早期患者微轉(zhuǎn)移，早期診斷，早期治療，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Sienel 等［19］認(rèn)為黑色素瘤抗原基因- A( melanoma antigen gene，MAGE -A) 在腫瘤組織表達(dá)，但在正常組織不表達(dá)，是一種微轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。該研究應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)對(duì)50 例可手術(shù)沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者骨髓穿刺進(jìn)行MAGE -A 檢測，有52%患者在原發(fā)腫瘤切除后仍有MAGE -A 表達(dá)，包括MAGE-A1、MAGE -A2、MAGE -A3/6、MAGE -A4、MAGE-A12。表明MAGE -A 轉(zhuǎn)錄與NSCLC 微轉(zhuǎn)移相關(guān)，影響預(yù)后。該研究認(rèn)為，標(biāo)志物代表了潛在的治療靶點(diǎn)，不僅需要用標(biāo)志物檢測微轉(zhuǎn)移，而且需要根除標(biāo)志物，以防止腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。因此將輔助性抗MAGE-A 免疫治療用于雙盲、隨機(jī)Ⅱ期臨床研究，182 例MAGE -A3 陽性表達(dá)完整手術(shù)切除的ⅠB/Ⅱ期NSCLC 患者用重組MAGE -A3 蛋白和一種免疫佐劑治療，隨訪21 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)免疫治療組(30%) 復(fù)發(fā)，安慰劑組(41%) 復(fù)發(fā)，降低了復(fù)發(fā)率。

3.判斷預(yù)后：微轉(zhuǎn)移會(huì)引起復(fù)發(fā)，使患者預(yù)后更差。肺癌的復(fù)發(fā)可能是在疾病早期沒有系統(tǒng)的監(jiān)測微轉(zhuǎn)移引起的。肺癌微轉(zhuǎn)移患者不僅有很高的復(fù)發(fā)率和腫瘤相關(guān)的病死率，而且無病生存期和總生存期顯著降低。Xi 等［20］通過微陣列檢查腫瘤基因表達(dá)譜可以顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，認(rèn)為肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后差。Benlloch 等［21］對(duì)Ⅰ期NSCLC 病理學(xué)陰性淋巴結(jié)進(jìn)行檢測，通過real -time RT -PCR 技術(shù)，檢測癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5( carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)和腭肺鼻上皮癌相關(guān)蛋白( palate lung and nasal epithelium carcinoma associated protein，PLUNC) 。發(fā)現(xiàn)CEACAM5 和PLUNC 在腫瘤組織中能夠表達(dá)，在良性組織中不表達(dá)，或者低表達(dá)。檢測344 枚淋巴結(jié)中13% CEACAM5 陽性，16% PLUNC 陽性。因此檢測CEACAM5、PLUNC 能評(píng)估NSCLC 病理學(xué)陰性的淋巴結(jié)是否存在NSCLC 微轉(zhuǎn)移，比現(xiàn)在常用的TNM 分期方法能更精確的評(píng)估復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)判斷預(yù)后有重要的意義。Dai 等［22］對(duì)Ⅰ～Ⅱb 期NSCLC 根治切除術(shù)后患者，應(yīng)用RT -PCR 技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)能檢測出脆性組氨酸三聯(lián)體基因( fragile histidine triad，F(xiàn)HIT) 和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因( cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A) mRNA 缺失，F(xiàn)HIT 或CDKN2A mRNA缺失者較未缺失者更易復(fù)發(fā)，5 年的無病生存率和總生存率降低，能預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后，該研究表明NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者降低了無病生存率和總生存率，NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是一個(gè)獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，表示預(yù)后差。

Nosotti 等［23］應(yīng)用real-time RT-PCR 技術(shù)對(duì)55例已行外科手術(shù)的Ⅰ期NSCLC 患者進(jìn)行檢測，利用CEA mRNA 標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)CEA mRNA 在20 例(36.3%)患者存在腫瘤細(xì)胞，提示存在NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。CEA mRNA 陽性患者對(duì)比CEA mRNA 陰性者在生存率和無病生存率上有顯著性的差異。多因素分析證實(shí)了NSCLC 微轉(zhuǎn)移是一個(gè)獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，患者有更短的無病生存率。譚思創(chuàng)等［24］收集43 例NSCLC 患者作為實(shí)驗(yàn)組，15 例良性肺部病變患者作為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過RT -PCR 檢測肺組織特異性蛋白X( lung-specific X protein，LUNX) mRNA 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組43 例患者的87 枚淋巴結(jié)中有33 枚( 37. 93%)LUNXmRNA 表達(dá)，對(duì)照組15 例患者的26 枚淋巴結(jié)中有2 枚(7.69%) 表達(dá)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0.05) ，RT -PCR 檢測LUNXmRNA 對(duì)比常規(guī)病理切片檢查LUNX mRNA 檢測有較高的敏感度。LUNX mRNA 是檢測肺癌微轉(zhuǎn)移的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)，可為今后制定治療方案、評(píng)估預(yù)后提供重要參考依據(jù)。

三、展 望

肺癌微轉(zhuǎn)移是引起復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因素，即使微轉(zhuǎn)移灶再小，甚至只有一個(gè)腫瘤細(xì)胞，只要它具有轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性就可以作為疾病處于進(jìn)展期的標(biāo)志物，和含有較多腫瘤細(xì)胞的大的轉(zhuǎn)移灶一樣能說明預(yù)后較差。臨床上常規(guī)病理學(xué)和影像學(xué)檢查只能發(fā)現(xiàn)較為明顯的轉(zhuǎn)移灶，而不能用于檢測微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移的檢測對(duì)判斷患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著重要的意義。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR 技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測，能夠提高診斷肺癌的準(zhǔn)確性，判斷預(yù)后，指導(dǎo)治療。目前PCR 技術(shù)在肺癌微轉(zhuǎn)移的應(yīng)用存在的主要問題是：檢測肺癌微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)； 尚無微轉(zhuǎn)移分期的金標(biāo)準(zhǔn)；尚無統(tǒng)一治療微轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，因此未來研究方向仍然主要是尋找最敏感、最特異的分子標(biāo)志物，確定微轉(zhuǎn)移的分期及治療手段。

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