陸夢漪(綜述)，張龍城(審校)

(1.桂林醫(yī)學院研究生學院，廣西 桂林 541004； 2.解放軍第三○三醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，南寧 530021)

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三維多孔支架血管化研究進展

陸夢漪1△(綜述)，張龍城2※(審校)

(1.桂林醫(yī)學院研究生學院，廣西 桂林 541004； 2.解放軍第三○三醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，南寧 530021)

摘要：三維(3D)多孔支架在組織修復與重建方面的應用研究是組織工程領域眾多研究中的一個重要方面。其中，功能性血管網絡的構建是其成功的關鍵。許多因素均能影響這一構建過程，比如支架材料的特性、血管生成的相關生長因子、生長因子的緩釋控制、支架與細胞聯合培養(yǎng)等。不論在支架材料選擇、血管生成相關因子應用及支架與細胞聯合培養(yǎng)中，聯合應用均呈現出更大的優(yōu)勢。

關鍵詞：3D多孔支架；組織工程；血管化

自1987年組織工程這一概念被正式提出以來，組織工程技術已廣泛運用于修復、替代機體受損組織與器官。其成功的關鍵在于是否能建立有效的血管網以滿足機體代謝需求。至此血管構建的設計與血管的生長機制方面的研究已取得了巨大進展。其中，3D多孔支架已成為再生醫(yī)學與組織工程中血管化研究的一個重要方面。近年來，大量實驗研究證明這些支架在體外培養(yǎng)與體內移植中都具備生成血管網的能力。因此，3D多孔支架血管化構建在組織修復與重建方面有著巨大的價值。

13D多孔支架材料

選擇適當的材料是3D多孔支架設計的第一步。支架材料可來源于任何自然界中已存在或人工合成的物質。理想的支架應該具有良好的生物相容性、多孔且滲透性佳，其機械強度與被替代組織相似，其降解速率與新生組織的生長速率接近?？紫兜闹睆酱笮?、形態(tài)與交通程度都能影響細胞黏附、遷移、生長。良好的支架應當利于液體流動，這讓營養(yǎng)分布更均勻，同時利于代謝產物和支架降解物及時運出[1]。

1.1生物高分子材料細胞外基質衍生物類高分子材料是一種較為普遍的支架材料。它們普遍存在于哺乳動物組織內，包括膠原、纖維蛋白凝膠、氨基葡聚糖等。膠原可用于修飾改變支架的力學特性、減緩支架的降解，其缺點是有引起機體免疫反應的潛在可能。纖維蛋白原參與機體損傷應答，在人工血管與骨重建研究中被廣泛應用。透明質酸為氨基葡聚糖中的一員，是相對分子質量為(50～500)×103的高分子材料，常被應用于眼科學、關節(jié)病治療與人造皮膚等領域。多糖類，如殼聚糖由于引起免疫反應較輕也被廣泛關注。Mohd等[2]將殼聚糖用于真皮修復與替代。Liu等[3]將多孔殼聚糖膜與聚四氟乙烯復合材料植入大鼠皮下，通過組織學評估顯示，這種支架能夠減少膠原沉積、促進血管生成。

1.2人工合成生物材料人工合成生物材料包括一些可降解聚酯纖維，如聚乳酸、聚羥基乙酸、聚已內酯，它們具有較好的生物相容性與降解性。其中，聚乳酸疏水性佳，因而不易水解，聚已內酯具有低玻璃化溫度、低熔點以及高熱穩(wěn)定性而適合于一些特殊加工，聚已內酯具有柔韌性且降解速率小于聚乳酸與聚羥基乙酸。聚酯類還能與其他材料聚合而改變其物理或化學特性。Li等[4]將聚已內酯與聚丙二醇、聚乙二醇分別聚合，獲得了一系列不同機械性能與降解率的聚合物。另外一些降解性佳的高分子聚合物，如水凝膠因其結構與細胞外基質接近也被廣泛關注。近年來，交聯支架越來越多的應用于血管化研究。Chan等[5]研究了膠原水凝膠交聯支架對于內皮細胞生理活動的影響，結果證明交聯支架更能促進新生血管的成熟與穩(wěn)定。

1.3生物陶瓷材料生物陶瓷具有與骨相似的化學成分及良好的生物相容性[6]。主要被用作骨與軟骨的重建與修復。如鈣-磷酸鹽陶瓷、二氧化鈦、氧化鋁、氧化鋯、生物活性玻璃等。其中鈣-磷酸鹽陶瓷，如羥基磷灰石、磷酸三鈣、雙相磷酸鈣被研究的最廣泛。鈣-磷酸鹽陶瓷具有一定的骨重建能力。但由于其力學性能較差，只局限應用于較小的填充移植或是作涂層材料。二氧化鈦、氧化鋁與氧化鋯是應用最廣泛的無機金屬陶瓷[7]。它們具有良好的延展性、耐磨性與生物相容性，常被移植于承重較多的部位。但它們易引起機體排斥反應且不會隨時間推移轉化為骨組織。血管化是骨重建的關鍵因素之一，生物陶瓷具備一定的血管化能力。Laschke等[8]將納米羥基磷灰石注射入倉鼠背部，2周后能檢測到血管內皮細胞與白細胞的相互作用。

2血管生成相關生長因子

不論是在體內或體外實驗中，3D支架在植入后必須與宿主的血管網建立聯系才能達到預期的效果。缺損組織在3D支架的幫助下修復或重建，它們也會如同身體其他組織修復一樣，逐漸出現血管形成與重塑的過程。許多生長因子直接或間接地作用于血管內皮細胞，參與血管生成過程。

2.1血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)VEGF是內皮細胞的有絲分裂原，通過與內皮細胞的直接作用而刺激血管生成。其家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD與胎盤生長因子，其中，VEGFA最具有代表性。根據VEGF-mRNA剪切方式的不同，VEGF還可以分為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，VEGF165效應最強。VEGF的受體包括VEGFR-1與VEGFR-2，它們僅在血管內皮細胞表面表達，增加血管通透性。VEGFR-2是主要的功能受體，在VEGF信號轉導與血管內皮形成過程中起主要作用。Kalka等[9]研究了在缺血性心肌血管新生過程中VEGF165對內皮祖細胞的動員作用，結果顯示血管數目隨VEGF劑量增加而增加，血管的密度卻相對恒定。因此，VEGF的劑量主要影響血管生成的數目。目前，VEGF已被運用于多種生物支架的血管化研究，如膠原蛋白支架、聚乙烯支架、聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架等[10-12]。

2.2堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)bFGF由中胚層來源的細胞與內皮細胞分泌，能調控內皮細胞、成骨細胞、成纖維細胞等細胞的分化、增殖、遷移與凋亡。它通過趨化作用誘導壁細胞分化，誘導細胞分泌膠原酶、蛋白水解酶，從而抑制細胞外基質降解[13]。bFGF的受體為酪氨酸激酶受體與主要成分為硫酸乙酰肝素蛋白多糖的肝素樣受體。bFGF對循環(huán)修復作用顯著，Zhao等[14]將明膠微球緩釋的bFGF運用于犬后肢缺血模型中，結果顯示bFGF能夠有效促進血管生成，改善后肢缺血。血管形成與bFGF的濃度多呈劑量依賴性，但當bFGF水平較高時會抑制內皮細胞的增殖和遷移。

2.3其他生長因子轉化生長因子β可以趨化成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞，促進其釋放VEGF，上調VEGF的表達。轉化生長因子β可在轉錄水平促進VEGF-mRNA的表達，從而促進血管形成。酸性環(huán)境與纖溶酶原都可上調轉化生長因子β的表達。血小板源生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)是血管平滑肌細胞的有絲分裂原，其家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D。在缺血模型中，PDGF-C可誘導內皮細胞與平滑肌細胞的遷移，促進VEGF分泌[15]。血管生成素(Ang)促進血管形成、重塑與成熟。其家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4。其中，Ang-1與Ang-2是與血管生成關系最密切的兩個因子。Ang-1可抑制內皮細胞凋亡、穩(wěn)定血管，促進內皮細胞遷移與血管生成，其作用類似于VEGF[16]。Ang-2是它的拮抗劑，其拮抗作用與局部VEGF含量有關。

3生長因子在構建3D多孔支架血管化中的運用

單一的生長因子運用于3D支架血管生成，結果并不理想。Nillesen等[17]發(fā)現VEGF與bFGF聯合使用比單獨使用更能有效降低環(huán)境含氧量、促進血管形成。生長因子的濃度也是影響血管生成的重要因素，微血管生長與VEGF及bFGF濃度呈劑量依賴性[18]。此外，VEGF和bFGF在無任何保護與調控的情況下迅速在體內代謝[19]。而高濃度VEGF持續(xù)作用于組織，則會生成大量畸形且無功能的血管[20]。因此，血管生長因子的緩釋對于3D支架血管化十分關鍵。用可降解的聚合物對生長因子多孔支架復合體進行包裹是一種緩釋方法。生物衍生水凝膠類，如膠原蛋白、透明質酸鈉以及明膠，具有生物相容性與惰性，適合作為包裹材料[20-22]。Han等[23]研究了聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己內酯)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚已內酯與明膠復合支架中VEGF與PDGF的釋放速率，結果顯示VEGF與PDGF的初濃度在兔左頸總動脈中能夠維持8周。

4聯合細胞培養(yǎng)在3D多孔支架血管化中的運用

近年來，聯合細胞培養(yǎng)在組織工程血管化中應用廣泛，尤其是3D支架在體內和體外的血管化構建。目前最常見的是與血管內皮細胞相關的聯合細胞培養(yǎng)，血管內皮細胞多來源于人臍靜脈。Hudon等[24]將人臍靜脈細胞與真皮成纖維母細胞共同載入膠原蛋白海綿生物支架中制備人工皮膚，結果發(fā)現一些血管分支結構形成，且能夠維持1個月以上。Wu等[25]將內皮細胞與平滑肌細胞共同種植于聚羥基乙酸-左旋聚乳酸材料3D多孔生物支架上，支架中能夠觀察到血管樣結構，在只種植有內皮細胞的支架中則無此種結構。此外，干細胞因其高度增殖分化能力，也被用作3D支架血管化的研究。Handel等[26]研究了人脂肪干細胞通過膠原涂層載入3D 45S5生物玻璃支架后，不論在人類臍靜脈內皮細胞相關的體外培養(yǎng)還是絨毛尿囊膜血管生成模型的體內試驗中，都顯示出良好的血管生成效應。Liu等[27]將胚胎骨髓間充質干細胞與血管內皮細胞在大孔隙支架中聯合培養(yǎng)14 d以上，早期能檢測到血管生成，且能增強支架的成骨效應。

5小結

3D多孔支架的血管化構建越來越引起重視，目前其構建方法很多，但或多或少存在一些缺點。如支架材料的選擇、支架孔隙率、表面化學性質及力學性能等特性的控制，生長因子或種子細胞的選擇，生長因子濃度及緩釋等因素都影響著最終的血管生成效應，而在實驗過程中，往往難以選擇出最佳條件。最終誘導的新生血管是否成熟，能否長期維持生理功能及安全性問題，仍需要進一步探索。無論是支架材料、生長因子還是細胞與支架聯合培養(yǎng)，聯合運用均顯示出更大的潛能和優(yōu)勢。相信隨著血管化研究的不斷深入，會有更加理想的血管化構建方法不斷涌現。

參考文獻

[1]Martin Y,Vermette P.Bioreactors for tissue mass culture:design,characterization,and recent advances[J].Biomaterials,2005,26(35):7481-7503.

[2]Mohd Hilmi AB,Halim AS,Jaafar H,etal.Chitosan dermal substitute and chitosan skin substitute contribute to accelerated full-thickness wound healing in irradiated rats[J].Biomed Res Int,2013,2013:1-13.

[3]Liu BJ,Ma LN,Su J,etal.Biocompatibility assessment of porous chitosan-Nafion and chitosan-PTFE composites in vivo[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(6):2055-2060.

[4]Li Z,Zhang Z,Liu KL,etal.Biodegradable hyperbranched amphiphilic polyurethane multiblock copolymers consisting of poly(propylene glycol),poly(ethylene glycol),and polycaprolactone as in situ thermogels[J].Biomacromolecules,2012,13(12):3977-3989.

[5]Chan KL,Khankhel AH,Thompson RL,etal.Crosslinking of collagen scaffolds promotes blood and lymphatic vascular stability[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(9):3186-3195.

[6]Kim HW,Kim HE.Nanofiber generation of hydroxyapatite and fluor-hydroxyapatite bioceramics[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2006,77(2):323-328.

[7]Fischer H,Weiss R,Telle R.Crack healing in alumina bioceramics[J].Dent Mater,2008,24(3):328-332.

[8]Laschke MW,Witt K,Pohlemann T,etal.Injectable nanocrystalline hydroxyapatite paste for bone substitution:in vivo analysis of biocompatibility andvascularization[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2007,82(2):494-505.

[9]Kalka C,Tehrani H,Laudenberg B,etal.VEGF gene transfer mobilizes endothelial progenitor cells in patients with inoperable coronary disease[J].Ann Thorac Surg,2000,70(3):829-834.

[10]Gao C,Harvey EJ,Chua M,etal.MSC-seeded dense collagen scaffolds with a bolus dose of VEGF promote healing of large bone defects[J].Eur Cell Mater,2013,26:195-207.

[11]Ye L,Wu X,Duan HY,etal.The in vitro and in vivo biocompatibility evaluation of heparin-poly(epsilon-caprolactone) conjugate for vascular tissue engineering scaffolds[J].J Biomed Mater Res A,2012,100(12):3251-3258.

[12]Lindhorst D,Tavassol F,von See C,etal.Effects of VEGF loading on scaffold-confined vascularization[J].J Biomed Mater Res A,2010,95(3):783-792.

[13]Folkman J,D′Amore PA.Blood vessel formation:what is its molecular basis?[J].Cell,1996,87(7):1153-1155.

[14]Zhao Y,Liu Z,Pan C,etal.Preparation of gelatin microspheres encapsulated with bFGF for therapeutic angiogenesis in a canine ischemic hind limb[J].J Biomater Sci Polym Ed,2011,22(4/6):665-682.

[15]Dimmeler S.Platelet-derived growth factor CC-a clinically useful angiogenic factor at last?[J].N Engl J Med,2005,352(17):1815-1816.

[16]Conway EM,Collen D,Carmeliet P.Molecular mechanisms of blood vessel growth[J].Cardiovasc Res,2001,49(3):507-521.

[17]Nillesen ST,Geutjes PJ,Wismans R,etal.Increased angiogenesis and blood vessel maturation in acellular collagen-heparin scaffolds containing both FGF2 and VEGF[J].Biomaterials,2007,28(6):1123-1131.

[18]Sukmana I,Vermette P.The effects of co-culture with fibroblasts and angiogenic growth factors on microvascular maturation and multi-cellular lumen formation in HUVEC-oriented polymer fibre constructs[J].Biomaterials,2010,31(19):5091-5099.

[19]Sakakibara Y,Nishimura K,Tambara K,etal.Prevascularization with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor enhances the benefits of cardiomyocyte transplantation[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2002,124(1):50-56.

[20]Springer ML,Chen AS,Kraft PE,etal.VEGF gene delivery to muscle:potential role for vasculogenesis in adults[J].Mol Cell,1998,2(5):549-558.

[21]Nagai N,Kumasaka N,Kawashima T,etal.Preparation and characterization of collagen microspheres for sustained release of VEGF[J].J Mater Sci Mater Med,2010,21(6):1891-1898.

[22]Chen J,Yang L,Guo L,etal.Sodium hyaluronate as a drug-release system for VEGF 165 improves graft revascularization in anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model[J].Exp Ther Med,2012,4(3):430-434.

[23]Han F,Jia X,Dai D,etal.Performance of a multilayered small-diameter vascular scaffold dual-loaded with VEGF and PDGF[J].Biomaterials,2013,34(30):7302-7313.

[24]Hudon V,Berthod F,Black AF,etal.A tissue-engineered endothelialized dermis to study the modulation of angiogenic and angiostatic molecules on capillary-like tube formation in vitro[J].Br J Dermatol,2003,148(6):1094-1104.

[25]Wu X,Rabkin-Aikawa E,Guleserian KJ,etal.Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(2):H480-487.

[26]Handel M,Hammer TR,Nooeaid P,etal.45S5-bioglass-based 3D-scaffolds seeded with human adipose tissue-derived stem cells induce in vivo vascularization in the CAM angiogenesis assay[J].Tissue Eng Part A,2013,19(23/24):2703-2712.

[27]Liu Y,Teoh SH,Chong MS,etal.Contrasting effects of vasculogenic induction upon biaxial bioreactor stimulation of mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells cocultures in three-dimensional scaffolds under in vitro and in vivo paradigms for vascularized bone tissue engineering[J].Tissue Eng Part A,2013,19(7/8):893-904.

Research Advances of Three-dimensional Porous Scaffolds Vascularization

LUMeng-yi1,ZHANGLong-cheng2.

(1.GuilinMedicalUniversityGraduateSchool,Guilin541004,China; 2.DepartemtofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery, 303rdHospitalofPeople′sLiberationArmy,Nanning530021,China)

Abstract：The three-dimensional(3D)porous scaffolds application in tissue repair and reconstruction is an important aspect in tissue engineering researches.The functional vascular network formation is the most important to the success of the reconstruction and restoration.Many factors can affect this process,such as the property of scaffolds,angiogenic factors,the controlled release of angiogenic growth factors,the co-culture with scaffolds,etc.No matter in the aspect of scaffolds material selection,angiogenic factors or the co-culture with scaffolds,combined application has a significant advantage.

Key words:3D porous scaffolds; Tissue engineering; Vascularization

收稿日期：2014-02-07修回日期：2014-06-29編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.037

中圖分類號：R318.08

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)01-0094-03