劉江濤，王霖霖(綜述)，郭 雄，龐清江(審校)

(1.寧波市第二醫(yī)院骨科中心，浙江寧波315010;2.寧波市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江寧波315010;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨病研究所，西安710061)

線粒體是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的雙層膜細(xì)胞器。線粒體具有自身的遺傳系統(tǒng)，但其基因組大小有限，且受核基因組的調(diào)控，所以是一種半自主的細(xì)胞器[1]。線粒體產(chǎn)生ATP為細(xì)胞供能，并在細(xì)胞中間代謝產(chǎn)物的氧化、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[2]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的場所，同時(shí)本身也是氧自由基攻擊的靶目標(biāo)[3]。線粒體功能障礙可引起細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，并啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡，其在幾乎所有疾病的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[4]。線粒體作為細(xì)胞病變或損傷時(shí)最敏感的指標(biāo)之一，對(duì)其功能的研究是分子細(xì)胞病理學(xué)檢查的重要內(nèi)容[5]?，F(xiàn)就線粒體功能學(xué)研究常用實(shí)驗(yàn)方法綜述如下。

1 線粒體的提取

蔗糖密度梯度離心法是提取線粒體的經(jīng)典方法[6]，其根據(jù)細(xì)胞各組分密度的不同，將細(xì)胞或組織勻漿液懸浮于均勻的懸浮介質(zhì)中，采用差速離心的方法進(jìn)行分離。緩沖的蔗糖溶液(0.25 mol/L蔗糖)比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，可在一定程度上保持各種細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)以及酶的活性，成為最常應(yīng)用的懸浮介質(zhì)。此外，在pH值=7.2的條件下，各亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。

蔗糖密度梯度離心法的一般步驟是先將細(xì)胞或組織制成勻漿，然后利用差速離心法在均勻的懸浮介質(zhì)中分離，其過程主要包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離及分析3步。目前這種方法已經(jīng)成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化性質(zhì)及其功能的主要手段。勻漿:在低溫條件下，將細(xì)胞或組織放到加入等滲勻漿介質(zhì)的勻漿器中進(jìn)行破碎，使之成為由各種細(xì)胞器及其包含物所組成的勻漿。分級(jí)分離:由低速到高速逐級(jí)離心沉降，先用低速沉淀較大的顆粒，再用較高的轉(zhuǎn)速沉淀浮在上清液中的顆粒，從而使細(xì)胞核、線粒體等各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)得以分離。由于樣品中各密度和大小不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻地分布在離心管中，所以每級(jí)離心第1次得到的沉淀必然不是純的最重的顆粒，還須反復(fù)懸浮、離心加以純化。分析:利用細(xì)胞化學(xué)和生化方法對(duì)分級(jí)分離得到的組分進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定，常用的是詹納斯綠活染法。

為保證獲得完整的線粒體，必須做到:①全程低溫操作，將樣品管放在冰水浴而不是碎冰塊中;②快速，微量制備操作更方便和快速，因而比大規(guī)模制備更易獲得完整的線粒體;③充分破碎細(xì)胞但不破壞亞細(xì)胞器是制備線粒體最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞(特別是貼壁細(xì)胞)用普通玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量且間隙嚴(yán)密的玻璃勻漿器，研杵上下充分研磨培養(yǎng)細(xì)胞。在相差顯微鏡下檢查見未裂解細(xì)胞在30%～50%即可，過度研磨會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)，研磨不足則會(huì)降低獲得率。

此外，線粒體分離提取試劑盒可以快速、簡單地從組織或細(xì)胞中分離出粗制線粒體。試劑盒提取的粗制線粒體可直接用于線粒體的研究，如線粒體結(jié)構(gòu)分析、功能研究及線粒體相關(guān)的凋亡研究等，并可用于制備純化線粒體及亞線粒體[7]。

2 線粒體耗氧量檢測

常用氧電極極譜法檢測線粒體的耗氧量[8]。線粒體耗氧量可分為內(nèi)源性耗氧量和呼吸鏈復(fù)合體耗氧量。內(nèi)源性耗氧量是指完整細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量，反映了完整細(xì)胞整個(gè)的氧化磷酸化能力;呼吸鏈復(fù)合體耗氧量是指洋地黃皂苷預(yù)處理的細(xì)胞，在加入特定的呼吸鏈復(fù)合體底物時(shí)單位時(shí)間的耗氧量，反映的是特定線粒體呼吸鏈復(fù)合體的氧化磷酸化能力。洋地黃皂苷能結(jié)合真核細(xì)胞膜上的膽固醇，在細(xì)胞膜上形成孔狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜的通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)外。亞細(xì)胞(如線粒體)膜結(jié)構(gòu)上膽固醇的水平非常低，因而不會(huì)造成通透性增高。因此，洋地黃皂苷處理的細(xì)胞完整地保存了細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入特定的呼吸鏈底物或抑制劑時(shí)，可準(zhǔn)確地反映特定線粒體呼吸鏈復(fù)合體的氧化磷酸化能力。常用的復(fù)合物Ⅰ底物為谷氨酸和蘋果酸，抑制劑為魚藤酮;復(fù)合物Ⅱ+Ⅲ底物為甘油-3-磷酸和琥珀酸，抑制劑為抗霉素;復(fù)合物Ⅳ底物為抗壞血酸和N，N，N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺，抑制劑為氰化鉀。

3 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測

常用分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ的活性[9]。樣品一般選擇分離純化的線粒體，每個(gè)呼吸鏈復(fù)合體檢測需要4～40 μg線粒體蛋白。為了比較不同細(xì)胞或組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合體的活性，需同時(shí)檢測三羧酸循環(huán)中的枸櫞酸合酶的活性作為對(duì)照。反應(yīng)體系在30℃進(jìn)行，反應(yīng)體積為200 μL 或1 mL。

復(fù)合物Ⅰ活性檢測的基本原理:由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide-reduced，NADH)的氧化，NADH減少，導(dǎo)致在340 nm處NADH的吸光度減少(NADH+H++泛醌1→NAD++泛醌1·H2)。

復(fù)合物Ⅱ活性檢測的原理:由于琥珀酸的氧化，二氯酚靛酚減少，導(dǎo)致在600 nm處二氯酚靛酚的吸光度減少(琥珀酸+泛醌1→延胡索酸+泛醌1·H2;泛醌1·H2+二氯酚靛酚→泛醌1+二氯酚靛酚·H2)。

復(fù)合物Ⅲ活性檢測的基本原理:由于氧化型細(xì)胞色素C的還原，還原型細(xì)胞色素C增加，導(dǎo)致在550 nm處還原型細(xì)胞色素C的吸光度增加(癸基泛醌·H2+氧化型細(xì)胞色素C→癸基泛醌+還原型細(xì)胞色素C)。

復(fù)合物Ⅳ活性檢測的基本原理:由于還原型細(xì)胞色素C的氧化，還原型細(xì)胞色素C減少，導(dǎo)致在550 nm還原型細(xì)胞色素C的吸光度減少(還原型細(xì)胞色素C+O2→氧化型細(xì)胞色素C+H2O)。

復(fù)合體Ⅴ活性檢測的基本原理:由于ATP酶水解ATP，NADH減少，導(dǎo)致在340 nm處NADH的吸光度減少(鎂·ATP→鎂·ADP+磷酸;鎂·ADP+磷酸烯醇式丙酮酸→鎂·ATP+丙酮酸;丙酮酸+NADH+H+→乳酸+NAD+)。

枸櫞酸合酶活性檢測的基本原理:由于5-硫-2-硝基苯甲酸根的形成，導(dǎo)致在412 nm處5-硫-2-硝基苯甲酸根的吸光度增加[草酰乙酸+乙酰輔酶A→枸櫞酸+輔酶A;輔酶A+5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)→輔酶A·硫代硝基苯甲酸+5-硫-2-硝基苯甲酸根]。

4 線粒體膜電位的檢測

線粒體在電子傳遞鏈中將H+從基質(zhì)泵至膜間隙，形成跨線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的線粒體膜電位。線粒體膜電位的維持是線粒體正常功能實(shí)現(xiàn)的必要條件，膜電位下降會(huì)導(dǎo)致線粒體ATP生成不足，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，其是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件之一[10]。膜電位的降低標(biāo)志著細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列改變:膜間通透性轉(zhuǎn)換孔道開放，線粒體內(nèi)膜通透性增高，內(nèi)膜H+梯度平衡失常甚至消失，此時(shí)，許多親脂性的陽離子化合物能夠結(jié)合到線粒體內(nèi)膜，可以利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的形態(tài)變化。

羅丹明123是最早發(fā)現(xiàn)的線粒體染色劑，其可特異性地被活細(xì)胞線粒體攝取，攝取率與線粒體膜電位呈正比，反映了線粒體膜電位的高低，其具有較好的靈敏性，可使用流式細(xì)胞儀或熒光分光光度計(jì)檢測熒光值的變化[11]。

四氯四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(5，5'，6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylben-zimidazole carbocyanide iodide，JC-1)是比羅丹明123更為敏感的熒光探針，它可以檢測組織、細(xì)胞或純化的線粒體的膜電位[12]。當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1以單體的形式存在，產(chǎn)生綠色熒光;當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光?；谶@種電壓依賴性的顏色轉(zhuǎn)變，JC-1是一個(gè)很好的電壓依賴性熒光染料，可利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)線粒體做定性和定量的分析。

此外，四甲基羅丹明甲酯也是一種應(yīng)用較多的陽離子熒光染料，單激光激發(fā)和單熒光發(fā)射峰可用540 nm激光激發(fā)，橙紅色熒光波長在620 nm左右[13]。相對(duì)其他熒光探針，四甲基羅丹明甲酯的主要優(yōu)點(diǎn)是染料在線粒體的積累僅源于膜電位變化，其與細(xì)胞器結(jié)合率低，適合做線粒體膜電位的定量分析，其相對(duì)毒性更小[14]。

5 ATP水平檢測

線粒體最重要的一個(gè)功能就是為細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)生成所需的ATP，因此檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平變化可直觀地反映線粒體的功能狀態(tài)。通常ATP水平的降低提示線粒體功能受損。在細(xì)胞凋亡時(shí)，ATP水平的下降通常伴隨線粒體膜電位的降低[15]。ATP的檢測可以用成色反應(yīng)、熒光、發(fā)光或同位素等方法實(shí)現(xiàn)。采用發(fā)光法檢測ATP具有更高的敏感性，而且簡便、快速，是目前最為流行的方法[16]。該方法是基于螢火蟲熒光素酶催化熒光素氧化，消耗ATP，從而發(fā)出光子的高效發(fā)光反應(yīng)，具有發(fā)光效率極高、發(fā)光量與ATP水平呈線性關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)。ATP是螢光素氧化反應(yīng)中的限制因素，光的強(qiáng)度與樣品中的ATP水平相關(guān)。

6 線粒體離子通道檢測

線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔是一種橫跨在線粒體內(nèi)外膜間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，通常為關(guān)閉狀態(tài)，是線粒體滲透轉(zhuǎn)換功能的基礎(chǔ)。線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔對(duì)細(xì)胞內(nèi)外多種離子水平的變化非常敏感。鈣超載或活性氧類生成等均可誘發(fā)線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔開啟[17]。線粒體大量滲透轉(zhuǎn)換孔的開啟可引起膜電位降低甚至崩解，導(dǎo)致線粒體功能損傷、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡。常用的線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔檢測方法有分光光度法、活性物質(zhì)標(biāo)記法及膜片鉗法等，其中分光光度法因簡單和方便而獲得較多應(yīng)用。

7 活性氧類水平檢測

在生物體內(nèi)，正常生理?xiàng)l件下線粒體能消耗90%以上氧分子產(chǎn)生的能量，約2%的氧分子由于不能被完全還原而與線粒體呼吸鏈電子漏發(fā)生反應(yīng)，生成超氧陰離子自由基[18]。細(xì)胞及線粒體基質(zhì)中有著完善的抗氧化體系，包括過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽系統(tǒng)及硫氧還蛋白系統(tǒng)等。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于一種平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平維持在一個(gè)比較低的生理范圍;在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平過多，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，并通過各種途徑釋放細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響組織和器官的功能[19]。因此，通過檢測細(xì)胞內(nèi)或線粒體活性氧類的水平，以及各種氧化防御體系酶的活性，可反映線粒體的功能狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)或線粒體活性氧類的水平可采用試劑盒直接檢測;超氧化物歧化酶的活性可通過鄰苯三酚自氧化法測定;谷胱甘肽系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，其在細(xì)胞抵抗活性氧類中起重要作用，谷胱甘肽的水平可通過5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)法測定;丙二醛的水平反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，可通過硫代巴比妥酸比色法測定[20]。

8 免疫蛋白印跡

免疫蛋白印跡常用的有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)，此外還有蛋白分離功能更強(qiáng)的雙向電泳。

SDS-PAGE是最常用的蛋白質(zhì)分離鑒定方法。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)為陰離子表面活性劑，其能夠破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶有更多的負(fù)電荷，因而掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異，導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量有關(guān)，而不再受原有電荷和分子形狀的影響。

BN-PAGE常用于線粒體呼吸鏈復(fù)合體、膜蛋白及同工酶的鑒定和提純，其是在不加入巰基乙醇、SDS等變性劑的條件下，對(duì)保持蛋白質(zhì)活性的樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。未加入 SDS等變性劑的天然PAGE能夠使生物大分子在電泳過程中保持天然的形狀和電荷，它們分離的依據(jù)是電泳遷移率和凝膠的分子篩作用，因而可以得到比較高的分離效率。電泳分離完成后仍能保持蛋白和酶等生物大分子的活性，因而對(duì)后續(xù)鑒定有重要的意義[21]。

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)已能分離出10000個(gè)斑點(diǎn)。其原理簡明:第一向是進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)會(huì)沿pH梯度分離，直至各自的等電點(diǎn);第二向是再沿垂直方向進(jìn)行分子量的分離;最后經(jīng)染色得到的電泳圖是一個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。在線粒體研究中，雙向電泳常被用來分離第一向BN-PAGE得到的線粒體呼吸鏈復(fù)合物，因而對(duì)于線粒體呼吸鏈復(fù)合物的鑒定有重要意義[22]。

9 線粒體DNA拷貝數(shù)

線粒體具有自己的基因組。一般來講，每個(gè)線粒體具有數(shù)以百計(jì)的線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA拷貝數(shù)的改變會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。常用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的變化。結(jié)合兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，對(duì)待測樣本中線粒體DNA和核基因分別進(jìn)行定量檢測，然后以核基因作為對(duì)照，對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量[23]。

10 小結(jié)與展望

線粒體功能受線粒體基因組和核基因組的雙重調(diào)控，對(duì)其準(zhǔn)確檢測需要聯(lián)合使用多種實(shí)驗(yàn)方法或生物技術(shù)。除上述常用方法外，可借助電子顯微鏡對(duì)線粒體形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行研究;線粒體代謝物活力可檢測乳酸、丙酮酸、乳酸脫氫酶等水平;線粒體DNA損傷可利用DNA測序技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性、DNA芯片技術(shù)及高效液相色譜技術(shù)等檢測。

雖然現(xiàn)在有很多方法可用來檢測線粒體的功能，但是由于實(shí)驗(yàn)方法的局限性、所涉及儀器的運(yùn)行成本及工作人員操作技能等限制，目前大多數(shù)方法仍局限于科研。隨著實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)的發(fā)展，更加可靠的綜合性全基因組分子診斷策略將會(huì)逐步建立和完善，這些線粒體功能學(xué)研究方法也終將應(yīng)用于臨床。

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