孫露銀(綜述)，閆彩鳳(審校)

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 揚州 225001)

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殼聚糖促進腸道上皮細胞吸收的機制

孫露銀△(綜述)，閆彩鳳※(審校)

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 揚州 225001)

摘要：多肽和蛋白質(zhì)類藥物具有高效、低毒及藥物間相互作用小的特性，使得它們越來越多地應用于臨床。胃腸道在人體和外界之間形成了一個選擇性屏障，允許營養(yǎng)物質(zhì)、水等通過的同時阻止蛋白和多肽等大分子物質(zhì)通過。因此，在過去的幾十年中，許多科學家致力于口服納米載體的研究。殼聚糖及其衍生物因具有黏膜黏附力、可逆地打開緊密連接及帶有正電荷的特性，已被作為安全有效的腸道吸收促進劑。腸道主要通過跨細胞或細胞旁途徑吸收物質(zhì)，而殼聚糖可促進跨細胞及細胞旁途徑的吸收。

關鍵詞：殼聚糖；腸道上皮細胞；吸收機制；緊密連接；通透性

由于胃酸的破壞、消化酶的降解以及難以跨越生物膜的機械屏障作用，蛋白多肽類藥物只能以靜脈、皮下注射等形式給藥，且往往需要長期反復給藥，為患者帶來極大的不便，因此開發(fā)蛋白多肽類藥物口服給藥系統(tǒng)意義重大。雖然各種載體的應用已經(jīng)大大提高了蛋白質(zhì)類藥物在胃腸道的吸收能力，但由于各種載體均有其自身局限性，至今仍沒有蛋白質(zhì)的口服制劑上市。為了解決蛋白質(zhì)類藥物的口服胃腸道吸收問題，需要對胃腸道生理結構和吸收機制進一步認識?，F(xiàn)以殼聚糖為例，對腸道上皮細胞的吸收機制進行綜述，為研發(fā)出更好的載體提供理論依據(jù)。本研究對殼聚糖促進腸道上皮細胞吸收的機制進行綜述。

1吸收途徑

大分子物質(zhì)在腸道的吸收主要通過跨膜運輸或者細胞旁途徑?？漳c、回腸的緊密連接相對疏松及跨膜電阻相對較低，并且小腸絨毛使得其吸收面積明顯擴大，因此藥物在腸道的吸收主要在小腸遠端，即空腸和回腸。而腸上皮細胞層是大分子物質(zhì)從腸腔吸收進入血液循環(huán)的主要屏障。腸上皮細胞層由腸道上皮細胞、M細胞和杯狀細胞組成。其中數(shù)量最多的為腸道上皮細胞，主要負責營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。其次為杯狀細胞，它可以分泌黏液，防止病原體的入侵。 數(shù)量最少的為M細胞，主要存在于小腸的遠端，回腸的派氏結，它能夠從腸腔攝取抗原和微生物，然后提供給潛在的黏膜免疫系統(tǒng)。隨著時間的進展，上皮細胞間的結構逐漸細化，并且明確了緊密連接是細胞旁吸收的主要屏障。

1.1跨膜運輸物質(zhì)的跨膜運輸方式主要有3種：被動運輸、主動運輸、胞吞和胞吐。大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等進行跨膜運輸?shù)闹饕绞綖榘毯桶?。腸道對納米藥物的攝取可通過胞吞作用，該過程和抗原的攝取相似。蛋白或多肽等大分子物質(zhì)口服給藥易被胃腸道蛋白酶降解。因此，為了提高口服吸收率及生物利用度，許多載體產(chǎn)生了。通過采用納米粒子的理化性質(zhì)，如粒徑、黏膜黏附能力、大分子的跨膜轉(zhuǎn)運得以增強。并且，納米粒子的跨膜轉(zhuǎn)運和粒子大小相關，隨著離子直徑的減小，納米粒子的跨膜運輸增強。粒子直徑<100 nm可能被腸上皮細胞吸收，而>500 nm可能被回腸派氏結的M細胞攝取。

1.2細胞旁途徑脂溶性藥物可通過跨膜途徑吸收，而一些大分子親水藥物(如多肽、蛋白質(zhì)類藥物)不能夠通過細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，因此細胞旁途徑成為其吸收的主要途徑。細胞旁途徑的吸收(即通過上皮細胞間的間隙)受緊密連接制約。緊密連接在機體中起著機械性連接、支持和封固作用,使細胞間聯(lián)系加強,避免受外力的作用而彼此分離。緊密連接一般圍繞著上皮細胞的頂端,呈連續(xù)的腰帶狀分布,與管腔之間形成一個滲透屏障,從而阻止管腔內(nèi)的物質(zhì)與細胞間隙內(nèi)物質(zhì)的任意互流,使兩者均可維持一定的濃度梯度。緊密連接形成一道屏障，允許從腸腔中吸收所需的水和電解質(zhì)，防止炎癥和感染因子等進入全身循環(huán)，對于維持機體的穩(wěn)態(tài)有著重要的意義[1]。緊密連接是物質(zhì)吸收的主要屏障，并且有研究表明，缺乏緊密連接的細胞層基本無屏障功能[2]。緊密連接蛋白claudins(CLDNs)可以分為3類：完整的跨膜蛋白、周邊相關的胞質(zhì)蛋白和信號蛋白[3]?？缒さ鞍装–LDNs、閉鎖蛋白、連接黏附分子，胞質(zhì)蛋白主要包括閉鎖小帶蛋白(zona-occluden，ZO)。信號蛋白起著黏附及信號轉(zhuǎn)導的作用，但對上皮細胞的通透性無影響[4-5]。 迄今為止，CLDNs家族有27種[6]，主要決定細胞旁途徑吸收的組織、大小、電荷選擇性。并且，生理學的證據(jù)表明CLDNs對緊密連接的屏障功能起決定性作用[7]。一些實驗證明，CLDN-7主要形成緊密連接鏈[8]；CLDN-1，-3,-4,-5,-8,-11,-14，-19和細胞旁緊密連接的強度有關[9]。CLDN-4,-8,-14為陽離子屏障，而CLDN-2,-7,-10,-13,-15,-16為陽離子和陰離子屏障[2]。值得注意的是，敲除超過90%的ZO-1和ZO-2并不導致緊密連接的斷裂[10]，表明只有一少部分的ZO蛋白參與了緊密連接的構成。并且，有研究表明，缺乏ZO-1蛋白，緊密連接不能形成[11]，提示ZO-1蛋白是形成緊密連接的必需部分。

最近的研究已經(jīng)闡明殼聚糖可以可逆地打開Caco-2細胞間的緊密連接，從而促進藥物的吸收[12]。Sonaje等[13]通過鑭(電子致密示蹤劑)染色展現(xiàn)了殼聚糖對緊密連接的開放。在實驗組，可在緊密連接之間及基底側觀察到鑭，而在對照組，主要在微絨毛表面觀察到鑭，表明沒有緊密連接開放。以上的結果表明，具有黏膜黏附功能的殼聚糖具有打開緊密連接的能力。

從理論上講，納米顆粒的細胞旁轉(zhuǎn)運是不可行的，因為上皮細胞間的間隙在天然狀態(tài)下為0.3~1 nm，這阻礙了大多數(shù)納米粒子的滲透。即便在緊密連接完全打開的狀態(tài)，細胞間的間隙最大只有20 nm，這限制了完整的殼聚糖納米粒的細胞旁途徑轉(zhuǎn)運。因此，大分子物質(zhì)的細胞旁途徑的運輸有賴于殼聚糖納米粒的裂解[14]?？赡艿臋C制為：殼聚糖納米粒能夠黏附和滲透黏液；滲透的納米粒變得不穩(wěn)定且使附近的上皮細胞表面松解，并促進其加載的藥物釋放。然后，由于殼聚糖介導，上皮細胞間的緊密連接已打開，其負載的藥物可進入血液循環(huán)。

2促進吸收的機制

2.1電荷依賴性生理狀態(tài)下，腸腔的pH為弱堿性，因此帶有正電荷的物質(zhì)易被腸道吸收。殼聚糖、多賴氨酸、聚乙烯亞胺等帶有正電荷的物質(zhì)可以使腸道上皮細胞模型的緊密連接打開，并且該過程是可逆的。但是，納米粒表面電荷對其吸收是否有影響仍有爭議。研究表明，和中性或帶有正電荷的納米粒相比，帶有負電荷的納米粒與腸道上皮細胞的親和力低[15]；而Shakweh等[16]發(fā)現(xiàn)的結果恰恰相反。

2.2增加黏膜黏附性增加納米粒的黏膜黏附能力是增加腸上皮細胞吸收率的有效方法。殼聚糖是一個眾所周知的黏膜黏附性聚合物，其黏附性是由于帶正電荷的殼聚糖和黏膜表面的帶負電荷的唾液酸殘基之間的靜電作用。這種相互作用可以延長殼聚糖納米粒同其黏附面的接觸時間，從而促進其口服吸收能力。并且，殼聚糖使得藥物在胃腸道的滯留時間明顯延長，這種黏附特性可促進跨細胞及細胞旁途徑的吸收。

2.3緊密連接的打開

2.3.1緊密連接相關蛋白的改變CLDNs同緊密連接的打開密切相關。經(jīng)殼聚糖處理后，CLDN-4從胞膜到胞質(zhì)重新分布，接著緊密連接的強度降低，最終使得細胞旁途徑的通透性增加[12]。并且，CLDN-1在緊密連接中高表達可使得細胞旁電阻降低，進而增加上皮細胞通透性[17]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖及其衍生物可誘導Caco-2細胞的肌動蛋白骨架重組[18]的同時，肌動蛋白的其他形態(tài)學沒有改變。此外，閉鎖蛋白、ZO-1蛋白也可能發(fā)生了改變。但是，一項關于HT-29/B6細胞模型的研究表明[19]，與Caco-2細胞模型不同，殼聚糖作用于HT-29/B6細胞模型后，大分子物質(zhì)細胞旁通透性的增加與CLDNs和ZO-1的表達、肌動蛋白骨架的形態(tài)學改變無關。隨著細胞旁電阻的降低，細胞旁通透性增加，但是具體機制尚不明確。

2.3.2蛋白激酶C(protein kinase C,CPK)激活目前，已發(fā)現(xiàn)的PKC亞型至少有10種[20]。通常情況下，PKC參與了緊密連接的打開或裂解，因此PKC的抑制會阻礙膜電阻的降低[21]。而殼聚糖激活了依賴PKC的信號通路，進而影響緊密連接的完整性，從而促進細胞旁轉(zhuǎn)運。但是也有研究表明，PKC亞型不同，對上皮細胞的通透性可能不同，有的甚至相反[22]。

2.4降低電阻物質(zhì)通過跨細胞途徑吸收需要克服跨膜電阻的作用。研究表明，殼聚糖納米粒可促進腸道的跨膜吸收[23-24]。并且，納米藥物促進跨膜運輸?shù)臋C制是降低腸上皮細胞的跨膜電阻[18-19]。

3毒性研究

在增加腸上皮細胞通透性的同時，是否會增加小腸內(nèi)毒素的吸收，目前仍是一個有爭議的問題。已有研究表明了殼聚糖納米粒對脂多糖(胃腸道最常見的毒素)吸收的影響。實驗結果表明[14]，負載胰島素的殼聚糖納米?？赏ㄟ^上皮細胞進入血液循環(huán)，但脂質(zhì)體卻不能透過，是因為陰離子脂質(zhì)體和帶負電荷的黏液層之間的電荷斥力。在體內(nèi)的毒性研究進一步證實了殼聚糖細胞旁滲透的提高不增加脂多糖吸收。因此，殼聚糖納米粒子作為口服給藥載體前景可觀。另一項研究表明[19]，殼聚糖的毒性與其濃度相關，在聚合物濃度為0.005%時，其降低跨膜電阻的力度最強且無毒，濃度<0.001%時，不具備降低跨膜電阻的能力，而濃度為0.01%時則具有細胞毒性。

4結語

腸道上皮細胞即是藥物吸收的主要場所，同時也是藥物吸收的主要屏障。大分子物質(zhì)(如蛋白及多肽)主要通過跨細胞或細胞旁途徑吸收。增強跨膜運輸主要通過降低跨膜電阻、增加黏膜黏附能力等途徑。而增強細胞旁途徑的運輸主要通過緊密連接的打開。緊密連接的打開主要與CLDNs、閉鎖蛋白、ZO蛋白的結構和形態(tài)學的改變以及PKC的激活有關。通過對這些機制的了解，可以研制出相應的載體，更好地實現(xiàn)藥物的控制釋放。目前緊密連接的結構尚未能完全闡明，緊密連接的打開機制尚未完全明確，需要更為深入的研究。

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Mechanisms of Chitosan Enhancing Intestinal Epithelium AbsorptionSUNLu-yin，YANCai-feng.(DepartmentofEndocrinology，NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001，China)

Abstract:Peptides and proteins featured with high efficiency,low toxicity and small drug interactions,are more and more applied in clinical practice.The gastrointestinal epithelium,forms the boundary between the body and external environment,effectively provides a selective permeable barrier that limits the permeation of peptide and protein,while allowing the appropriate absorption of nutrients and water.Over the past decades,many researchers have developed various nanoparticles for oral delivery systems.Chitosan (CS),a cationic polysaccharide,is widely regarded as a safe and efficient intestinal absorption enhancer of therapeutic macromolecules,owing to its inherent mucoadhesive feature and ability to modulate the integrity of epithelial tight junctions reversibly.The epithelial cells create this selective permeability by two pathways:the transcellular and the paracellular route.As an efficient absorption enhancer and drug carrier,CS increases both transcellular and paracellular transports of macromolecules across the intestinal epithelium.

Key words:Chitosan; Intestinal epithelium; Absorption mechanism; Tight junction; Permeability

收稿日期：2014-12-01修回日期：2015-03-13編輯：薛惠文

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.015

中圖分類號：R58；R944

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)20-3686-03