付明娟，林接玉(綜述)，謝捷明(審校)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，福州 350004； 2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，福州 350001)

?

包涵體蛋白復(fù)性的研究進(jìn)展

付明娟1△，林接玉1,2(綜述)，謝捷明1※(審校)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，福州 350004； 2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，福州 350001)

摘要：包涵體是指外源重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集的無活性的固體顆粒。經(jīng)分離、洗滌除去一些膜蛋白或膜碎片后，用適宜試劑溶解,如高pH值加低濃度的尿素緩沖液、不同羥基的醇類或含小分子的變性劑。傳統(tǒng)的稀釋、透析等復(fù)性方法效率一般較低，目前可通過高靜水壓、沸石的高通量篩選及高通量篩選結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件的方法提高復(fù)性效率。希望可以找到一種適于所有重組蛋白的高效、簡(jiǎn)便的復(fù)性方法，實(shí)現(xiàn)不易獲得的外源重組蛋白簡(jiǎn)易的規(guī)模化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞:包涵體；蛋白質(zhì)；復(fù)性

目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，具有非常廣闊的發(fā)展前景。大腸埃希菌因易于操作、遺傳背景清楚、生產(chǎn)成本低及表達(dá)水平高而被廣泛應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的獲取。因大腸埃希菌體內(nèi)缺重組蛋白正確折疊的適宜條件而形成聚集體，即包涵體[1]，盡管其具有不易被菌體內(nèi)蛋白酶分解、表達(dá)量多等優(yōu)點(diǎn)，但如何將無生物活性、錯(cuò)誤折疊的不溶蛋白轉(zhuǎn)變成有活性的可溶蛋白這一難題仍困擾著人們，而且其復(fù)性效率一般較低，L-精氨酸等促進(jìn)復(fù)性物質(zhì)的應(yīng)用及沸石的高通量篩選等新的復(fù)性方法的建立都極大地增加了包涵體蛋白復(fù)性產(chǎn)率[2]?，F(xiàn)就包涵體的溶解、復(fù)性方法及如何提高蛋白復(fù)性產(chǎn)率進(jìn)行綜述，以期找到一種適于所有包涵體的復(fù)性方法。

1包涵體

1.1包涵體的定義與特性包涵體是指重組蛋白在大腸埃希菌體內(nèi)大量集聚形成的一種明顯不同于細(xì)胞質(zhì)中的其他成分。其一般包含大部分既無天然結(jié)構(gòu)又無活性的重組蛋白，還有少量菌體蛋白等物質(zhì)，呈無定形狀態(tài)[3]，密度較大，一般難溶于水，但可溶于含有促溶劑，如L-精氨酸的變性劑尿素、鹽酸胍等。核磁共振等新技術(shù)的應(yīng)用證明了包涵體可通過適宜的方法使其復(fù)性從而獲得生物活性[4]。

1.2包涵體的制備

1.2.1分離含重組蛋白基因的大腸埃希菌先擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，然后離心棄上清即可獲得大量菌體，其可通過超聲破碎[5]或化學(xué)方法，如溶菌酶裂解分離出包涵體，其中前一種方法獲得的包涵體含雜質(zhì)較多，不易純化，若兩種方法結(jié)合可以獲得純度較高的包涵體。

1.2.2洗滌為除去包涵體上黏附的雜質(zhì)，如一些膜碎片和膜蛋白等，包涵體通常用低濃度的變性劑洗滌。

1.2.3溶解去垢劑或變性劑是一般常用的包涵體溶解劑，常用的去垢劑(如十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸等)可破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解包涵體。常用的變性劑有6～8 mol/L的尿素或鹽酸胍，可破壞蛋白間的氫鍵，使蛋白增溶。對(duì)人重組粒細(xì)胞刺激因子包涵體蛋白溶解和復(fù)性的研究發(fā)現(xiàn)，堿性(pH值約為10)環(huán)境能有效溶解該蛋白，低濃度的尿素具有協(xié)同作用，且此法更有利于蛋白的復(fù)性[6]。近幾年，含有不同羥基醇類的變性劑對(duì)人類生長(zhǎng)激素包涵體蛋白溶解的研究認(rèn)為，6 mol/L正丙醇加2 mol/L尿素的溶解效果最好。雖然此條件溶解的蛋白量比用強(qiáng)變性劑溶解的蛋白量少，但此法溶解的蛋白復(fù)性產(chǎn)率較后兩者高[7]。另外，有報(bào)道，在3.5 mol/L 鹽酸胍變性液中加入8 mmol/L半胱氨酸可有效溶解包涵體且極大地提高了其后續(xù)蛋白復(fù)性產(chǎn)率[8]。

2包涵體的復(fù)性

因包涵體不具有重組蛋白天然的空間結(jié)構(gòu)從而失去了生物活性，故需要采用適宜的復(fù)性方法使重組蛋白進(jìn)行正確的重折疊，重新獲得生物活性。

2.1包涵體蛋白復(fù)性方法

2.1.1稀釋復(fù)性目前稀釋復(fù)性是生物制藥學(xué)中最簡(jiǎn)單、使用最廣泛的一種復(fù)性方法，為減少重組蛋白的聚集、增加其復(fù)性率，宜采用低濃度的重組蛋白在大的攪拌槽中進(jìn)行復(fù)性。影響因素很多，如pH等[9]。此法已成功用于α乳清蛋白的復(fù)性[10]。

2.1.2超濾復(fù)性超濾復(fù)性易于對(duì)復(fù)性過程進(jìn)行控制，較多地應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中，通過適宜的裝置借助離心力除去變性劑而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的復(fù)性，但離心力過大可能會(huì)使重組蛋白永久性復(fù)性。

2.1.3透析復(fù)性透析復(fù)性通過緩慢降低變性劑濃度使蛋白復(fù)性，此過程消耗時(shí)間長(zhǎng)，不適于規(guī)?；a(chǎn)，但可以保持蛋白體積不變，如成纖維生長(zhǎng)因子8已用此法成功實(shí)現(xiàn)復(fù)性[11]。

2.1.4液相色譜復(fù)性目前液相色譜復(fù)性在生產(chǎn)中已成功應(yīng)用，如疏水相互作用色譜[12]、離子交換色譜[6]、凝膠排阻色譜[13]、親和色譜[14]。包涵體蛋白變性后在色譜柱上復(fù)性，其復(fù)性回收率高、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)小。

2.1.5反膠束復(fù)性法該法[15]利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反相膠團(tuán)為包涵體蛋白復(fù)性提供適宜的環(huán)境。在一定條件下將水溶性蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核中，再創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，達(dá)到分離的目的。

2.1.6雙水相復(fù)性法雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成。與一般分離純化技術(shù)相比，雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、活性損失小、分離步驟少、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)。此方法已成功用于金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)因子G的復(fù)性[16]。

2.2影響包涵體蛋白復(fù)性的因素包涵體重組蛋白的復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，既與包涵體自身形成的原因有關(guān)，又需要其正確折疊的外部環(huán)境。

2.2.1復(fù)性初始濃度包涵體重組蛋白的復(fù)性產(chǎn)率與其正確折疊速度和聚集速度的相對(duì)大小有關(guān)，低濃度的重組蛋白可以減少其分子間相互碰撞而聚集沉淀從而顯著提高重組蛋白的復(fù)性效率[17]。操作過程中可采用磁力攪拌使重組蛋白在其復(fù)性全程中處于低濃度狀態(tài)。

2.2.2pH值復(fù)性過程中最佳的pH不但可以防止與重組蛋白的等電點(diǎn)重合而聚集，又可以避免重組蛋白中自由基的質(zhì)子化而使其永久性變性，從而大大提高了蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率。

另外，影響蛋白質(zhì)復(fù)性的因素有高靜水壓[18]、蛋白復(fù)性容器、包涵體溶解劑等。

2.3促進(jìn)包涵體蛋白復(fù)性的方法

2.3.1高濃度的蛋白復(fù)性一種簡(jiǎn)易的高產(chǎn)率復(fù)性方法可采用高濃度的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，如把高濃度的重組蛋白在不斷攪拌的條件下，緩慢的分階段的加入到稀釋緩沖液中，如Chen和Leong[19]采用脈沖式pulsed fed SEC(SEC)，使α胎球蛋白的復(fù)性濃度大大提高，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其高效率的復(fù)性；在高流體靜水壓的條件下復(fù)性[20]；通過控制復(fù)性過程中的溫度：先低溫后高溫，減少重組蛋白的聚集體的生成，提高其復(fù)性產(chǎn)率。

2.3.2添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法常用促進(jìn)劑如下。①共溶劑：可降低重組蛋白的聚集沉淀而提高其復(fù)性產(chǎn)率，如聚乙二醇6000～20 000 )[21]。②去污劑[22]或表面活性劑：可增加包涵體重組蛋白的穩(wěn)定性，如rition X-100等可促進(jìn)重組蛋白的復(fù)性。③氧化-還原劑：適宜的氧化還原環(huán)境可提高含二硫鍵的包涵體重組蛋白的復(fù)性效率，如在復(fù)性過程中加入谷胱甘肽(氧化型/還原型)、二硫蘇糖醇/谷胱甘肽還原型[23]、二硫赤蘚醇/谷胱甘肽還原型等氧化還原對(duì)。④低分子添加劑：如人鳥苷三磷酸酶活化蛋白[24]、L-精氨酸[25]等，其可通過穩(wěn)定包涵體重組蛋白中間體的穩(wěn)定性促進(jìn)其復(fù)性。⑤重組蛋白折疊酶[26]：如硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、FK506結(jié)合蛋白、親環(huán)蛋白等可降低包涵體重組蛋白的錯(cuò)誤折疊，增加其正確折疊而提高復(fù)性產(chǎn)率。⑥人工伴侶：可降低重組蛋白中間體聚集沉淀而促進(jìn)其復(fù)性，如xynB64在復(fù)性過程中加入環(huán)糊精提高其正確折疊率[27]。

2.3.3其他提高復(fù)性產(chǎn)率的策略還有許多，如多壁碳納米管復(fù)性，其已成功用于木聚糖酶的復(fù)性過程中[28]。已有研究發(fā)現(xiàn)，利用沸石[29]的高通量篩選進(jìn)行蛋白復(fù)性，因?yàn)榉惺且环N多孔的晶狀鋁硅酸鹽，不同的SiO2/Al2O3比例表現(xiàn)出不同的離子交換特性和疏水性，它最大的優(yōu)點(diǎn)是在高濃度鹽存在的情況下，蛋白也可以被很好地吸附。最近，有研究報(bào)道，將高通量復(fù)性篩選和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件相結(jié)合的兩步復(fù)性條件篩選，此法需要蛋白量低、但耗時(shí)短[30]。

3展望

包涵體復(fù)性的瓶頸是提高蛋白濃度和生物活性，近年來人們?cè)谶@方面做了很多研究，但至今沒有一種復(fù)性方法適于所有包涵體蛋白，故需人們對(duì)其做更深一步的探索研究。最近Lu和Lin[31]發(fā)現(xiàn)有活性的包涵體存在；Sans 等[32]通過優(yōu)化表達(dá)巖藻糖苷酶的培養(yǎng)條件獲得了具有生物活性的包涵體，并且其生物活性比用傳統(tǒng)培養(yǎng)條件獲得的可溶性蛋白的生物活性更高。雖然包涵體蛋白研究還處在初級(jí)階段，但其潛力巨大，不容忽視。

參考文獻(xiàn)

[1]Qoronfleh MW,Hesterberg LK,Seefeldt MB.Confronting high-throughput protein refolding using high pressure and solution screens[J].Protein Expr Purif,2007,55(2):209-224.

[2]Nuc P,Nuc K.Recombinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem,2006,52(4):448-456.

[3]Singh SM,Panda AK.Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins[J].Biosci Bioeng,2005,99(4):303-310.

[4]寧云山,李妍,王小寧,等.包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2001,12(3):237-240.

[5]汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:166-183.

[6]Li M,Fan H,Liu J,etal.High pH solubilization and chromatography-based renaturation and purification of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor from inclusion bodies[J].Appl Biochem Biotechnol,2012,166(5):1264-1274.

[7]Singhc SM,Sharma A,Upadhyay AK,etal.Solubilization of inclusion body proteins using n-propanol and its refolding into bioactive form[J].Protein Expr Purif,2012,81(1):75-82.

[8]Tsuji I,Mastui H,Ito T,etal.L-cysteine-enhanced renaturation of bioactive soluble tumor necrosis factor ligand family member LIGHT from inclusion bodies in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2011,80(2):239-245.

[9]王蘋,井健.重組人膜聯(lián)蛋白的尿激酶原融合蛋白衍生物的復(fù)性及制備[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2012,48(6):626-629.

[10]包義風(fēng).包涵體蛋白復(fù)性技術(shù)研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2012,40(2):84-88.

[11]黃鵬煌,王澤,田海山,等.重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b原核表達(dá)載體的構(gòu)建和純化研究[J].中國(guó)生物工程雜志,2013,33(1):14-19.

[12]Geng X,Wang L.Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs[J].Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,866(1/2):133-153.

[13]Wellhoefer M,Sprinzl W,Hahn R,etal.Continuous processing of recombinant proteins:integration of refolding and purification using simulated moving bed size-exclusion chromatography with buffer recycling[J].J Chromatogr A,2013,1319:107-117.

[14]Shi ZX,He F,Wang LL,etal.Expression,refolding,and purification of a truncated human Delta-like1,a ligand of Notch receptors[J].Protein Expr Purif,2008,59(2):242-248.

[15]Vinogradov AA,Kudryashova EV,Levashov AV,etal.Solubilization and refolding of inclusion body proteins in reverse micelles[J].Anal Biochem,2003,320(2):234-238.

[16]Li JJ,Venkataramana M,Sanyal S,etal.Immobilized beta-cyclodextrin polymer coupled to agarose gel properly refolding recombinant Staphylococcus aureus elongation factor-G in combination with detergent micelle[J].Protein Expr Purif,2006,45(1):72-79.

[17]劉曉飛,裴劍竹,杜國(guó)俊,等.蛇毒蛋白原核表達(dá)包涵體復(fù)性研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2011,31(3):113-119.

[18]Chura-Chambi RM,Cordeiro Y,Malavasi NV,etal.An analysis of the factors that affect the dissociation of inclusion bodies and the refolding of endostatin under high pressure[J].Process Biochemistry,2013,48(2):250-259.

[19]Chen Y,Leong SSJ.High productivity refolding of an inclusion body protein using pulsed-fed size exclusion chromatography[J].Process Biochemistry,2010,45(9):1570-1576.

[20]Cothran A,St John RJ,Schmelzer CH,etal.High-pressure refolding of human vascular endothelial growth factor (VEGF) recombinantly expressed in bacterial inclusion bodies:refolding optimization,and feasibility assessment[J].Biotechnol Prog,2011,27(5):1273-1281.

[21]Gerami S M N,Farajnia S,Mahboudi F.Co-solute assistance in refolding of recombinant proteins[J].African J Biotechnol,2013,10(53):10811-10816.

[22]Yamamoto E,Yamaguchi S,Nagamune T.Synergistic effects of detergents and organic solvents on protein refolding:control of aggregation and folding rates[J].Biosci Bioeng,2011,111(1):10-15.

[23]Dang S,Hong T,Bu D,etal.Optimized refolding and characterization of active C-terminal ADAMTS-18 fragment from inclusion bodies of Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2012,82(1):32-36.

[24]Zilinskas A,Sereikaite J.Probing of some compounds as anti-aggregatory additives in the protein refolding process from Escherichia coli inclusion bodies[J].Biotechnol Appl Biochem,2011,58(4):277-284.

[25]Tsumoto K,Ejima D,Nagase K,etal.Arginine improves protein elution in hydrophobic interaction chromatography.The cases of human interleukin-6 and activin-A[J].Chromatogr A,2007,1154(1/2):81-86.

[26]Han GJ,Dong XY,Sun Y.Purification effect of artificial chaperone in the refolding of recombinant ribonuclease A from inclusion bodies[J].Biochem Engineering J,2013,77:15-19.

[27]申寧,白羽,蔣宏宇,等.飼料用耐熱木聚糖酶包涵體蛋白的復(fù)性[J].飼料工業(yè),2012,33(10):25-28.

[28]Shah S,Gupta MN.Simultaneous refolding,purification and immobilization of xylanase with multi-walled carbon nanotubes[J].Biochim Biophys Acta,2008,1784(2):363-367.

[29]Nara TY,Togashi H,Sekikawa C,etal.High-throughput protein refolding screening method using zeolite[J].Biotechnol Prog,2009,25(4):1071-1077.

[30]Dechavanne V,Barrillat N,Borlat F,etal.A high-throughput protein refolding screen in 96-well format combined with design of experiments to optimize the refolding conditions[J].Protein Expr Purif,2011,75(2):192-203.

[31]Lu SC,Lin SC.Recovery of active N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase from inclusion bodies by solubilization with non-denaturing buffers[J].Enzyme Microb Technol,2012,50(1):65-70.

[32]Sans C,García-Fruitós E,Ferraz RM,etal.Inclusion bodies of fuculose-1-phosphate aldolase as stable and reusable biocatalysts[J].Biotechnol Prog,2012,28(2):421-427.

The Research Progress of Inclusion Body Protein RenaturationFUMing-juan1,LINJie-yu1,2,XIEJie-ming1.(1.DepartmentofPharmacology,FujianMedicalUniversityPharmacyCollege,Fuzhou350004,China; 2.DepartmentofPharmacy,UnionHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

Abstract:Inclusion bodies are the inactive solid particles agglutinating by exogenous recombinant protein in cells.After separation and washing to remove some pieces of membrane proteins or film,they can be dissolved by appropriate reagent,for example the buffer with high pH value and low concentration of urea,alcohol with different hydroxyl or denaturant containing small molecule.The renaturation efficiency traditional renaturation method such as dilution,dialysis is generally low.At present,we can improve refolding efficiency through high pressure,high throughput screening of zeolite and high-throughput screening combined with experimental design software.We wish to find an efficient renaturation method suitable for all recombinant proteins,so as to realize large-scale production of recombinant proteins which are difficult to obtain.

Key words:Inclusion body； Protein； Renaturation

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-04-28編輯：相丹峰

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 (30772587)；福建省自然科學(xué)基金 (C0510012，2011J01188)；福建醫(yī)科大學(xué)重大科研項(xiàng)目(09ZD012)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.004

中圖分類號(hào)：R963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)20-3657-03