吳梅青

(湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湘潭 411102)

蓮子心為睡蓮科水生草本植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的胚根及幼葉［1］，既可入藥，也可食用。蓮子心含有黃酮類化合物、生物堿等活性成分，具有降血壓、抗心律失常、抑制血小板聚集、抗氧化及清除活性自由基、抗心肌缺血、松弛平滑肌、強心、抗癌、腦缺血損傷保護、改善急性肺損傷及肺纖維化、中樞抑制、降血糖等藥理作用［2］。蓮子心中黃酮類化合物有蕓香苷、金絲桃苷、木犀草素等，是蓮子心中重要的活性成分。大量研究表明，黃酮類化合物除具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱解毒等作用外，對冠心病、心絞痛等疾病也有較好的治療效果。黃酮類化合物安全、無毒，已在醫(yī)藥、食品加工等方面得到廣泛應(yīng)用［3］。筆者就近年來國內(nèi)外對蓮子心中黃酮類化合物的提取測定及抗氧化和抑菌活性等方面的研究進展進行綜述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 蓮子心總黃酮的提取分離方法比較

1.1 提取分離方法

1.1.1 水浸提法 水浸提得到的是黃酮苷類物質(zhì)。肖貴平［4］以建蓮蓮心為原料，以水為提取溶劑，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交實驗確定水浸提蓮心黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為浸提溫度90℃、浸提時間45min、料液比3∶100，在此條件下蓮心黃酮類物質(zhì)提取率為0.99%。由于蓮子心黃酮類物質(zhì)具有酚羥基，顯酸性而易溶于堿水，故可用堿水提取，堿水提取液加酸酸化，黃酮類物質(zhì)游離以沉淀的形式析出。蔡定建等［5］用石灰水從蓮子心中提取黃酮類物質(zhì)，再用鹽酸(HCl)調(diào) pH到適宜值，黃酮類物質(zhì)的提取率為0.41%。該法雖然提取率低，但經(jīng)濟、安全、方便，所得產(chǎn)品質(zhì)量好，是實際生產(chǎn)中常用的方法。

1.1.2 醇提法 由于乙醇無毒，還能增加蓮子心的滲透性，提高黃酮類物質(zhì)的溶解度，所以乙醇是最常用的提取溶劑。周芳［6］以總黃酮提取量及浸膏得率為指標(biāo)，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計考察乙醇濃度、提取時間、料液比對提取效果的影響，確定了最佳提取工藝為20倍量70%乙醇提取2次，第一次1.5 h，第二次1 h。在此工藝條件下總黃酮物質(zhì)的提取率為2.17%。醇提法的提取效率高于水提法，但提取成本也較高。

1.1.3 超聲輔助提取法 超聲波輔助提取法是利用超聲波的空化作用，破壞蓮子心細胞，使溶劑易于滲入細胞內(nèi)，同時超聲波的許多次級作用也能加速細胞內(nèi)有效成分的擴散、釋放和溶解，促進提取的快速進行，增加了黃酮類物質(zhì)在溶劑中的溶解。周燕芳［7］采用超聲波輔助提取的方法，通過正交試驗提取蓮子心黃酮，以40%乙醇作提取劑，按料液比1∶50(m∶V)，在60℃下采用超聲波提取60min，蓮子心總黃酮提取率1.80%，提取效果優(yōu)于熱回流提取法。肖貴平［8］用超聲輔助醇提法，對影響蓮心黃酮類物質(zhì)提取率的主要因素進行單一比較分析，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對實驗進行優(yōu)化設(shè)計，測得黃酮類物質(zhì)提取率為2.56%，與傳統(tǒng)微波水提取方法相比，該方法提取率較高，提取時間較短。

1.1.4 微波輔助提取法 微波可直接作用于分子，使其熱運動加劇，溫度升高，這種熱效應(yīng)使微波穿透到介質(zhì)內(nèi)部，加速細胞壁的破壞，使蓮子心黃酮類物質(zhì)更快地被分離提取出來。余其鳳等［9］采用單因素實驗和正交試驗確定微波輔助提取蓮子心總黃酮的優(yōu)化工藝條件為乙醇濃度65%、固液比1∶25(g·mL－1)、微波輻射功率400 W、微波輻射時間30 s×3(間歇作用3次)，在此工藝條件下，蓮子心總黃酮提取率1.00%。肖貴平［10］采用微波輔助提取方法，對影響蓮心黃酮類物質(zhì)提取率的主要因素進行單一比較分析，利用正交試驗進行優(yōu)化提取工藝，確定微波功率700 W，提取10min，料液比2∶100工藝條件下黃酮類物質(zhì)提取率為1.87%，與傳統(tǒng)水浸提法比較發(fā)現(xiàn)，微波法提取效率明顯優(yōu)于水浸提法，且能為后續(xù)工序節(jié)約時間、能源和成本。

1.1.5 酶輔助提取法 該法是利用適當(dāng)?shù)拿?，通過酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，最大限度地從植物體內(nèi)提取有效成分的新技術(shù)。該法提取效率高，還可將提取液中的雜質(zhì)如果膠、蛋白質(zhì)、淀粉等分解除去，從而簡化后續(xù)純化工序。其中纖維素酶和果膠酶最常用于黃酮類物質(zhì)的提取。肖貴平［11］為有效提高蓮心中黃酮類物質(zhì)的提取效果，采用果膠酶輔助提取方法，通過L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)選其最佳工藝條件為酶解溫度50℃、pH4.5、酶用量0.6 mg·mL－1、酶解時間 2.0 h，在此條件下蓮心黃酮類物質(zhì)提取率1.27%，與傳統(tǒng)水提取工藝(90℃、45min)相比，蓮心黃酮類物質(zhì)提取率提高了28.64%。林志欽等［12］在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定了纖維素酶提取工藝的最佳參數(shù)為50%乙醇、液料比 19∶1、纖維素酶添加量 0.3%、pH5.5、在60℃下酶解2 h，測得總黃酮得率4.50%。

1.1.6 超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，集萃取分離于一體。它通過使植物細胞壁高度破碎，增加黃酮類物質(zhì)與溶劑的接觸面積和萃取通道，同時還使黃酮與纖維素結(jié)合力降低，從而提高萃取率［13］。季愛民等［14］采用乙醇為夾帶劑，萃取溫度45℃，萃取壓力6.5 MPa，用超臨界CO2流體萃取法從蓮子心中萃取親脂性成分，萃取物得率2.50%。

1.1.7 大孔吸附樹脂分離法 大孔吸附樹脂主要用于水溶性化合物的分離純化，是目前應(yīng)用最多也較為實用的分離純化方法。影響因素主要有樹脂的型號和性質(zhì)、被吸附物的性質(zhì)、上樣液的pH、上樣量、洗脫劑的性質(zhì)等。曾紹校等［15］采用X-5型大孔吸附樹脂對蓮子心總黃酮進行純化，確定的最佳工藝條件為上樣液含量為5 mg·mL－1，上樣液pH6，上樣量2 BV，洗脫劑為50%乙醇4 BV，洗脫劑流速2 BV·h－1，純化后蓮子心總黃酮純度可達50%。

1.2 7種提取分離方法的比較 上述7種提取方分離法的優(yōu)缺點比較見表1。楊明等［16］比較了乙醇法、微波法、超聲波法等3種提取方法提取蓮子心中黃酮的效果。結(jié)果表明，乙醇法得到的黃酮含量低，超聲波法和微波法所得的結(jié)果比較接近，但從所用時間看，建議選用微波法。

2 蓮子心黃酮的檢測方法

2.1 主要檢測方法

2.1.1 紫外-可見分光光度法 紫外-可見分光光度法測定黃酮的基本原理是以蘆丁為對照品，硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，全波段掃描最大吸收峰，測定其吸光度，以此來計算含量。該方法是目前測定天然藥物中黃酮含量的主要方法。張麗珍等［17］以蘆丁為對照品，以聚酰胺柱色譜分離，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，510 nm作為測定波長，用分光光度法測定6批蓮子心藥材中的總黃酮含量，含量0.66% ～1.52%。此方法簡便、準確、快速、靈敏度高，但特異性差，只適用于總黃酮的測定。

2.1.2 高效液相色譜(HPLC)法 目前，分析和鑒定黃酮類物質(zhì)最常用的方法是HPLC法，一般采用反相柱，反相體系則一般優(yōu)先選擇甲醇/水及乙腈/水體系為流動相，還需要加入酸調(diào)節(jié)pH，抑制解離，克服拖尾現(xiàn)象，為了提高分離度需要梯度洗脫，多用C18柱分離［18］。曾建偉等［19］以 Ultimate C18(250mm ×4.6mm，5 μm)為色譜柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(40∶60)，流速為 1.0mL·min－1，檢測波長 256 nm，柱溫30℃，用HPLC法測定蓮子心中蘆丁含量，蘆丁進樣量在 0.122 ～ 1.094 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，RSD為1.72%，測得4個不同產(chǎn)地蓮子心蘆丁的平均含量為0.14%，未檢測到金絲桃苷和木犀草素。

2.1.3 毛細管電泳-安培檢測法 蓮子心黃酮類物質(zhì)含有較多的酚羥基，在堿性條件下帶負電荷，而且酚羥基容易氧化，可以得到較好的電化學(xué)響應(yīng)信號，適合于毛細管電泳-安培檢測法的檢測分析。在檢測過程中主要考慮檢測電位、運行緩沖液濃度和pH，分離電壓和進樣時間對分離和檢測的影響。許雪琴等［20］采用毛細管電泳-柱端安培檢測法測定蓮子心中蘆丁和金絲桃苷的含量，以微碳圓盤電極(φ=0.5mm)為工作電極，檢測電位為0.95 V(vs.Ag/AgCl)，pH 為7.25 的50mmol·L－1Na2B4O7和100mmol·L－1NaH2PO4緩沖液為運行液，當(dāng)分離電壓為15 kV時，在15min內(nèi)完全分離，荷葉堿、蘆丁和金絲桃苷檢出限(S/N=3)分別為 0.02，0.05 和0.04 μg·mL－1，并測得蓮子心中荷葉堿、蘆丁和金絲桃苷的含量分別為0.41%、0.11% 和0.0 82%，檢測結(jié)果令人滿意，可為蓮子心的質(zhì)量控制提供快速的分析方法。

2.2 檢測方法比較 以上3種檢測方法都有其優(yōu)點和不足。紫外-可見分光光度法具有設(shè)備簡單、適用性廣、準確度和精密度較好的特點，但特異性差，目前只用來測定天然藥物中總黃酮含量;毛細管電泳-安培檢測法具有高分辨率和低檢測限的優(yōu)勢，在檢測天然藥物黃酮中的應(yīng)用越來越多，但要求被檢測物質(zhì)具有良好的電化學(xué)活性，檢測范圍受到限制;HPLC法既有分離又有檢測功能，結(jié)果準確，還可以檢測到單體化合物;近年發(fā)展的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在對黃酮定性定量測定的同時，還可以對單體成分的結(jié)構(gòu)進行鑒定，是檢測蓮子心中未知黃酮組分的有效手段。

3 蓮子心中黃酮類化合物抗氧化和抑菌活性

黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、解毒護肝和細胞保護作用，并對心血管、機體內(nèi)分泌和代謝、細胞均有影響［21］。它能通過血腦屏障，吸收活性自由基，具有很強的抗氧化活性，并能將起催化氧化作用的金屬離子絡(luò)合，具有抗氧化、抗衰老的作用［22］。黃酮類化合物是蓮子心的活性成分之一，在抗氧化和抑菌活性方面研究較少，現(xiàn)綜述如下。

3.1 抗氧化、清除自由基作用 傳統(tǒng)合成抗氧化劑存在一定毒性，甚至可致畸、致癌，許多國家開始限制甚至禁止使用某些合成抗氧化劑，而多酚類物質(zhì)中黃酮類化合物因在自然界分布廣泛、抗氧化活性強、毒副作用低而備受關(guān)注［23］。張敏等［24］通過研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心水提液可較好地清除Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子，能明顯降低小鼠肝、腎勻漿自氧化產(chǎn)生的丙二醛(malondialdehyde，MDA)，同時對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的小鼠紅細胞溶血有較明顯的抑制作用，說明蓮子心水提液具有很強自由基清除能力，對組織細胞以及亞細胞膜性結(jié)構(gòu)有保護作用。張俊生等［25］參照Fenton反應(yīng)建立羥基自由基生成模型，測得當(dāng)蓮子心總黃酮的濃度為21.78 μg·mL－1時，對羥基自由基的清除能力達到12.16%;采用國際通用的烘箱強化貯存法，65℃下測得對植物油的抗氧化能力強于對動物油的抗氧化能力，說明蓮子心黃酮提取物可作為天然抗氧化劑使用。

3.2 抑菌作用 細菌耐藥性是全球公共衛(wèi)生面臨的最嚴重的威脅之一，也迫切需要尋找新的有效治療藥物。黃酮是廣泛存在于植物中的一類化合物，具有直接抑菌、協(xié)同抑菌及抑制細菌毒性等作用［26］，作用機制主要通過抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶、抑制細菌細胞質(zhì)膜的功能、抑制細菌能量代謝等方面發(fā)揮抑菌功效［27］。曾紹校等［15］研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心總黃酮對沙門菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌等 細 菌 的 最 低 抑 菌 濃 度 分 別 為 0.5，1，2，4，4 mg·mL－1，蓮子心總黃酮的抑菌活性與蘆丁相近，結(jié)果為蓮子心黃酮作為天然防腐劑的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。

4 展望

黃酮類化合物只存在于植物中，對其提取、分離、檢測技術(shù)的研究很重要。隨著現(xiàn)代提取、分離、鑒定技術(shù)的發(fā)展，超臨界流體技術(shù)、半仿生提取技術(shù)、連續(xù)逆流提取技術(shù)、膜分離技術(shù)等在蓮子心黃酮類化合物的提取分離中將會得到廣泛應(yīng)用，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等一些現(xiàn)代分析工具的應(yīng)用也會日趨增多。

我國蓮子心資源十分豐富，從蓮子心中提取的黃酮安全、無毒，具有清除自由基和抗氧化活性功能，也具有明顯的抑菌作用，因此蓮子心黃酮具有較高的開發(fā)價值。隨著對蓮子心黃酮抗氧化、抑菌活性的進一步研究，特別是體內(nèi)抗氧化、抑菌活性的研究，使其在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病以及抗衰老等方面有著廣泛的前景，并將有助于其在藥品、化妝品、保健品、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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