郭金英，杜 潔，李彤輝，任國艷，王 萍，張玉先，李政軍

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

發(fā)狀念珠藻胞外多糖的抑菌與抗炎作用

郭金英，杜 潔，李彤輝，任國艷，王 萍，張玉先，李政軍

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

采用BG-11培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻，提取發(fā)狀念珠藻胞外多糖。通過測濾紙片周圍抑菌圈直徑大小，研究發(fā)狀念珠藻胞外多糖抑菌作用；通過研究發(fā)狀念珠藻胞外多糖對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響及對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響，探究它的抗炎性能。結(jié)果表明，發(fā)狀念珠藻多糖在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對研究的幾種細(xì)菌及青霉和紅曲霉都有一定的抑菌作用，而對根霉無抑制作用；其能夠有效緩解二甲苯和角叉菜膠引起的小鼠耳部與足部炎癥。發(fā)狀念珠藻胞外多糖具有一定的抑菌抗炎性。

發(fā)狀念珠藻；胞外多糖；抑菌性；抗炎性

近年來，天然生物性 藥品由于療效好、對人體毒害性小甚至沒有毒副作用而受到人們普遍的重視和喜愛。生物活性多糖生理活性廣泛，已被證明有抑菌性和抗炎性。Matsui等[1]報道了紅藻硫酸多糖抑制皮膚出現(xiàn)紅斑。常向東等[2]發(fā)現(xiàn)葛仙米水溶性多糖有抑制霉菌、大腸桿菌及綠膿桿菌的活性。Martins等[3]研究表明傘菇多糖能夠促進(jìn)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞殺死感染的白色念珠菌。生物活性多糖的抗菌和抗炎作用越來越受到重視。

發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）屬于念珠藍(lán)細(xì)菌科念珠藍(lán)細(xì)菌屬[4]，俗稱發(fā)菜、地毛、龍須菜等，是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛分布的可食用陸生念珠藻[5]。我國主要分布在西部和北部的干旱半干旱荒漠地區(qū)。作為一種食品，發(fā)狀念珠藻在我國已有近兩千年的歷史，其藥用價值也早有記載[6-7]。同時，又因其在生態(tài)上的特殊性和經(jīng)濟(jì)價值而倍受關(guān)注[8-9]。發(fā)狀念珠藻多糖是一種酸性雜多糖，由木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖組成，是一種極具開發(fā)潛力的天然藥物資源[10-14]。目前關(guān)于發(fā)狀念珠藻多糖生物活性的研究尚處于起步階段，雖已證明這種多糖具有抗病毒[15]、抗氧化[16]等功能，但對于它的抑菌及抗炎活性的研究尚未見報道。因此，本研究主要對發(fā)狀念珠藻多糖的抑菌性與抗炎性進(jìn)行研究，以待為它的深入開發(fā)利用奠定堅實的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)菌與培養(yǎng)基

地塞米松 大連第三制藥廠；其他均為國產(chǎn)分析純。

細(xì)菌：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌；真菌：青霉、根霉、紅曲霉。均由河南科技大學(xué)微生物實驗室提供。

細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、牛肉膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂7.5 g，加蒸餾水至500 mL，調(diào)pH值為7.0～7.2，高壓滅菌；真菌培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮切塊）100 g、葡萄糖10 g、瓊脂7.5 g，加蒸餾水至500 mL，高壓滅菌[17]。

1.2 動物

健康ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自河南科技大學(xué)動物實驗中心。

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-SⅡ全自動蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱 常州普天儀器制造有限公司；101-0電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SF2000數(shù)顯游標(biāo)卡尺 桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)狀念珠藻胞外多糖制備

取100 mL發(fā)狀念珠藻培養(yǎng)液經(jīng)絹篩過濾去藻體，濾液用蛋白酶-Sevag法脫蛋白，然后將脫蛋白的多糖溶液裝入選擇性半透膜，透析48 h去除小分子物質(zhì)；透析后，加入50 mL無水乙醇，4 ℃靜置24 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥獲得胞外多糖。

1.4.2 菌懸液的制備

在對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上活化各個菌種，37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌24 h，28 ℃培養(yǎng)真菌48 h?；罨?，用接種環(huán)各挑取一環(huán)于滅菌生理鹽水中，使分布均勻，制成含菌數(shù)約為107～108CFU/mL的系列菌懸液。

1.4.3 多糖液的制備

將0.2 g發(fā)狀念珠藻多糖溶于10 mL無菌水中，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的多糖液，再依次稀釋成10、5、2.5、1.25 mg/mL的多糖液。

1.4.4 抑菌實驗

采用濾紙片擴(kuò)散法[18]。用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的小圓片若干，裝于6 個干燥的離心管中，高壓滅菌后再將其干燥。然后將不同質(zhì)量濃度的多糖液加入其中5 個離心管中，剩下的一個加入無菌水作為空白對照，浸泡30 min。于超凈工作臺上將滅菌后的培養(yǎng)基倒入無菌平板，待其冷卻后，在培養(yǎng)基上加入適量不同菌懸液，涂布均勻。再用鑷子夾取含不同濃度多糖液的小圓片輕貼于培養(yǎng)基表面，每個平板6 片，分別代表5 個質(zhì)量濃度和1 個空白對照，每種菌種3 個平板。最后將細(xì)菌平板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌平板置28 ℃培養(yǎng)48 h后，各自取出比較抑菌圈直徑大小。

1.4.5 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[19]

將癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠隨機(jī)分成5 組，每組8 只，包括空白對照組，陽性對照組及發(fā)狀念珠藻多糖低、中、高劑量組。各組每天定時給藥劑量為0.1 mL/10 g（以體質(zhì)量計，下同），連續(xù)4 d，其中空白對照組灌胃生理鹽水，陽性對照組腹腔注射地塞米松。最后一次給藥前30 min在每只小鼠左耳廓兩側(cè)均勻涂布0.03 mL二甲苯，右耳作自身對照。最后一次給藥4 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，剪下小鼠兩耳，并分別在兩耳同一部位用打孔器打取6 mm耳片，稱質(zhì)量。計算腫脹度，即左耳片與右耳片質(zhì)量的差值。

1.4.6 對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響[20]

將ICR小鼠隨機(jī)分成5 組，每組8 只，包括空白對照組，陽性對照組及發(fā)狀念珠藻多糖低、中、高劑量組。各組每天定時給藥劑量為0.1 mL/10 g，連續(xù)4 d，其中空白對照組灌胃生理鹽水，陽性對照組腹腔注射地塞米松。最后一次給藥1 h后，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測定它們的右后足厚度，之后于每只小鼠右后足進(jìn)行皮下注射0.05 mL 1 g/100 mL的角叉菜膠致炎，24 h后再次測定右后足厚度。計算腫脹度，即致炎后與致炎前厚度的差值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)狀念珠藻多糖抑制細(xì)菌作用

表1 發(fā)狀念珠藻多糖抑制細(xì)菌效果（x±s,n=8）Table 1 Antibacterial effects of Nostoc flfl agelliforme exopolysaccharides（x±s,n=8）

由表1可知，發(fā)狀念珠藻多糖對幾種細(xì)菌都有一定的抑制作用，尤其對沙門氏菌抑制作用效果最好，抑制作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)；對于大腸桿菌，在多糖質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL和2.5 mg/mL時，抑制效果不明顯，隨著多糖質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，抑制作用有所增強(qiáng)；多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時才開始對枯草芽孢桿菌有抑制作用；多糖質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，之后多糖質(zhì)量濃度越高，抑制效果越明顯。

2.2 發(fā)狀念珠藻多糖抑制真菌作用

表2 發(fā)狀念珠藻多糖抑制真菌效果（x±s,n=8）Table 2 Antifungal effects of Nostoc flfl agelliforme exopolysaccharides（x±s,n=8）

由表2可知，發(fā)狀念珠藻多糖抑制青霉與紅曲霉，而對根霉沒有抑制作用。隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，多糖抑制青霉及紅曲霉能力逐漸增強(qiáng)；10 mg/mL和20 mg/mL的多糖對紅曲霉的抑制作用沒有明顯差別。

2.3 發(fā)狀念珠藻多糖對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

表3 發(fā)狀念珠藻多糖對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（x±s,n=8）Table 3 Effects of Nostoc flfl agelliforme exopolysaccharides on mouse ear swelling induced by xylene（x±s,n=8）

由表3可知，發(fā)狀念珠藻多糖能夠顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹，并呈一定的量效關(guān)系，說明發(fā)狀念珠藻多糖能夠有效緩解二甲苯造成的小鼠耳部炎癥。與空白對照組相比，發(fā)狀念珠藻多糖低、中劑量均顯著降低小鼠耳腫脹度量，差異極顯著；發(fā)狀念珠藻多糖高劑量降低小鼠耳腫脹度，但差異無顯著性。

2.4 發(fā)狀念珠藻多糖對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

表4 發(fā)狀念珠藻多糖對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響（x±s,n=8）Table 4 Effects of Nostoc flfl agelliforme polysaccharides on the swelling of hind paws in mice induced by carrageenin（x±s,n=8）

由表4可知，與空白對照組相比，發(fā)狀念珠藻多糖低劑量顯著降低小鼠足腫脹度，發(fā)狀念珠藻多糖中劑量差異顯著，而發(fā)狀念珠藻多糖高劑量差異不顯著。發(fā)狀念珠藻多糖劑量越高，小鼠足腫脹度越高，說明低劑量發(fā)狀念珠藻多糖對角叉菜膠引起的小鼠足部炎癥抗炎效果最好。

3 討 論

藍(lán)藻是一類結(jié)構(gòu)簡單的原核生物，目前，超過100 種藍(lán)藻被發(fā)現(xiàn)具有分泌胞外多糖的能力，與植物多糖和大型海藻多糖相比，藍(lán)藻多糖具有更好的物理或生態(tài)特性[21]。不同藍(lán)藻多糖的抑菌活性有差異[22]。鄧慶華等[23]研究黑木耳多糖發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)菌作用比霉菌強(qiáng)。王憲偉[24]通過竹蓀多糖對幾種菌最小抑制質(zhì)量濃度的比較，確定了其抑制活性高的菌種。本研究表明發(fā)狀念珠藻多糖在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對研究的菌種具有一定的抑菌效果。

炎癥是機(jī)體受到有害刺激后，在受刺激部位產(chǎn)生的系列復(fù)雜病理過程。在此過程中，致炎因素引起毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加等反應(yīng)，尤其在一些慢性疾病中會損傷機(jī)體。因此，抗炎效果好且毒副作用小的生物抗炎藥品成為迫切需求，關(guān)于它的研究也得到普遍重視。

二甲苯能夠刺激諸如緩激肽、組織胺等炎癥介質(zhì)的釋放，使毛細(xì)血管通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤，從而引起小鼠耳殼腫脹。劉立新等[25]進(jìn)行胡蘿卜多糖的抗炎性研究時，運用二甲苯致炎，觀察發(fā)現(xiàn)其能夠有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹，且多糖劑量越大，抑制作用越強(qiáng)。張庭延等[26]研究報道了金櫻子多糖的抗炎作用，證明其能夠明顯抑制小鼠耳部由二甲苯引起的炎癥。本研究表明，發(fā)狀念珠藻多糖能夠有效緩解二甲苯造成的小鼠耳部炎癥，并呈一定的量效關(guān)系。角叉菜膠引起小鼠足腫脹是目前建立炎癥水腫模型的一種典型方法，炎癥反應(yīng)中表現(xiàn)出細(xì)胞浸潤與特征性的炎性滲出。本實驗結(jié)果顯示，低劑量發(fā)狀念珠藻多糖對小鼠足部炎癥抗炎效果最好。

綜上所述，發(fā)狀念珠藻胞外多糖有一定的抑菌及抗炎活性，而關(guān)于它的抑菌、抗炎作用機(jī)制還有待于深入研究。

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Antimicrobial and Antiinflammatory Activities of Extracellular Polysaccharides from Nostoc fl agelliforme

GUO Jinying， DU Jie， LI Tonghui， REN Guoyan， WANG Ping， ZHANG Yuxian， LI Zhengjun
(College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China)

Extracellular polysaccharides from Nostoc fl agelliforme in liquid suspension culture with BG-11 medium were obtained. By measuring the diameter of the inhibition zone using fi lter paper disc diffusion method, the antimicrobial activity of the exopolysaccharides against different bacteria and fungi were evaluated, and the anti-infl ammatory activity was also tested by examining their effects on the mouse ear swelling induced by xylene and the swelling of hind paws in mice induced by carrageenin. The results showed that Nostoc fl agelliforme extracellular polysaccharides could inhibit Penicillium and Monascus to a certain degree, but had no inhibitory activity on Rhizopus. Nostoc fl agelliforme extracellular polysaccharides could effectively alleviate the infl ammation of mouse ears and hind paws induced by xylene and carrageenin. Therefore, Nostoc fl agelliforme extracellular polysaccharides have certain antimicrobial and antiinfl ammatory activities.

Nostoc fl agelliforme; extracellular polysaccharides; antimicrobial activity; antiinfl ammatory activity

R285.5

A

1002-6630（2015）09-0190-04

10.7506/spkx1002-6630-201509035

2014-06-22

河南省重點科技攻關(guān)計劃項目（142102110038）；河南科技大學(xué)博士科研啟動基金項目

郭金英（1971—），男，副教授，博士，研究方向為食物新資源。E-mail：guojinying8@163.com