袁美蘭，陳麗麗，吳潤鋒，趙 利*，張婭楠，魏麗莉

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌 330013）

輔料改善草魚魚糜凝膠性能的機理

袁美蘭，陳麗麗，吳潤鋒，趙 利*，張婭楠，魏麗莉

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌 330013）

以草魚為原料，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)構(gòu)分析和化學作用力測定等方法，研究輔料改善草魚魚糜凝膠性能的機理。結(jié)果表明：草魚魚糜蛋白自溶最適溫度和pH值分別為65 ℃和6.5；馬鈴薯淀粉對魚糜蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的填充能力強于膠原蛋白，而膠原蛋白對魚糜組織蛋白酶的抑制效果好于馬鈴薯淀粉；輔料加入后，改變了魚糜蛋白間的離子鍵、氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵等化學作用力，從而達到改善魚糜品質(zhì)的目的。

草魚魚糜；輔料；自溶；魚糜品質(zhì)

為提高淡水魚糜制品凝膠強度，近年來，馬鈴薯淀粉[1-6]、牛血漿[4]及蛋清粉[2-3，7-8]等食品輔料被廣泛用于魚糜生產(chǎn)。馬鈴薯淀粉、牛血漿蛋白及蛋清粉中含有一些特殊的抑制成分，這些抑制成分可與魚肉內(nèi)源蛋白酶爭奪活性位點。有研究表明，蛋清粉和牛血漿蛋白的添加能夠增強比目魚（flatfish）魚糜制品的凝膠強度[9]，還能提高太平洋無須鱈（Pacific hake）魚糜制品的應變力[10]。由于牛血漿蛋白不僅能夠抑制蛋白酶活性，還可以與蛋白發(fā)生交聯(lián)作用，因此牛血漿蛋白被認為是目前最為有效的蛋白酶抑制劑，但是牛血漿蛋白因瘋牛病的危害而被禁用[11]，而蛋清粉最大的不足就是會使魚糜產(chǎn)生不良風味和色澤，同時近年來禽流感的傳播也導致蛋清粉的使用受限，因此尋找更好的替代輔料成為目前急需解決的問題。

國內(nèi)外對魚糜制品的諸多研究中，多數(shù)以馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和甘薯淀粉等作為篩選對象，大多認為添加馬鈴薯淀粉可以更好地提高低值魚糜的凝膠強度[12]。同時也有研究者發(fā)現(xiàn)鮰魚皮中的膠原蛋白可以顯著提高草魚魚糜凝膠強度[13]。目前，國內(nèi)外鮮有關于膠原蛋白和馬鈴薯淀粉增強魚糜凝膠性能的機理報道。因此，本實驗以草魚為對象，研究魚糜中輔料的作用、組織蛋白酶活性和魚糜凝膠性能三者之間的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚：活魚，購自南昌市下羅農(nóng)貿(mào)市場，每條質(zhì)量800～1 500 g；馬鈴薯淀粉，購自南昌市下羅農(nóng)貿(mào)市場；百合粉、紫山藥粉、葛粉，購自南昌市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)楓林大道樂買佳超市。

魔芋精粉、蔗糖、山梨醇 南昌市長城生物制劑有限公司；魚皮膠原蛋白和魚頭酶解物 江西科技師范大學國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心；大豆蛋白 南昌市下羅農(nóng)貿(mào)市場；乳清蛋白 南昌市寶靈生物制劑有限公司。Tris、考馬斯亮藍R-250 北京Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）美國Sigma公司；尿素 天津大茂化學試劑廠；β-巰基乙醇 美國Amresco公司；過硫酸銨 北京夏斯生物有限公司；甘氨酸 美國Sanland-chem International公司；30%甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺（N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 上海Beyotime公司；250 kD標準蛋白質(zhì) 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

TJ12-H型絞肉機 廣東恒聯(lián)食品機械有限公司；JJ1000型精密電子天平 常熟雙杰儀器廠；T25 basic型分散機 德國IKA公司；F-2700型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Delta320 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；TDL-5A型離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；WSC-S型色差計 上海精密科學儀器有限公司；CT3型質(zhì)構(gòu)儀 美國Brookfield公司；HHS-型恒溫電熱水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PowerPac Basic型電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜肌原纖維蛋白在不同溫度下的自溶實驗

參考Nishimoro等[14]的方法并略作修改。稱取漂洗后的草魚魚糜樣品6 組，質(zhì)量均為0.5 g，在pH值約7.0條件下，溫度分別為5、35、45、55、65、75 ℃條件下放置90 min，分別取出樣品并溶解到3 mL 20 mmol/L Tris-HCl（2.0% SDS，8.0 mol/L尿素，2.0% β-巰基乙醇，pH 8.0）緩沖液中，沸水浴3 min，然后室溫放置24 h，使蛋白質(zhì)充分溶解出來，離心后取出一定量上清液進行電泳實驗[15]。

1.3.2 魚糜肌原纖維蛋白在不同pH值條件下的自溶實驗

稱取漂洗后的草魚魚糜樣品6 組，質(zhì)量均為0.5 g，分別加入到pH值為3.5、4.5、5.5、6.5、 7.5、8.5的1 mL Tris-HCl緩沖液中，于65 ℃條件下靜置90 min，其后分別離心去水，取出樣品進行電泳處理，步驟同1.3.1節(jié)。

1.3.3 加入不同輔料后魚糜肌原纖維蛋白的自溶實驗

分別取11 組草魚魚糜樣品，其中10 組分別含3%的不同輔料，1 組為空白對照，根據(jù)實驗1.3.1節(jié)及1.3.2節(jié)結(jié)果，選取草魚魚糜的最佳自溶溫度及p H值條件，并在該條件下將11 組樣品放置90 min，其后進行電泳處理，步驟同1.3.1節(jié)。

1.3.4 加入不同輔料后魚糜肌原纖維蛋白經(jīng)過不同時間的自溶實驗

分別取3 組草魚魚糜樣品，其中2 組分別含3%馬鈴薯淀粉和膠原蛋白，1 組為空白對照，3組樣品在最佳自溶溫度及pH值條件下分別放置30、60、90、120 min，其后進行電泳處理，步驟同1.3.1節(jié)。

1.3.5 加入不同輔料后經(jīng)歷不同時間自溶后凝膠強度的測定

稱取一定量魚糜樣品若干份，分別添加3%的不同種類的輔料，在最佳條件下分別放置30、60、90 min和120 min，再進行灌腸、凝膠化（40 ℃加熱30 min后再90 ℃加熱30 min），用質(zhì)構(gòu)儀分別測定破斷強度和凹陷深度，最后計算出凝膠強度[16]。質(zhì)構(gòu)儀測試條件如下：采用直徑5 mm的球形探頭（TA50），觸發(fā)點負載4.5 g，探頭壓縮距離15 mm，探頭測試速率1.0 mm/s，每組取3 個平行樣品，每個樣品重復測6 次，取平均值，凝膠強度計算見如下公式。

1.3.6 加入不同輔料后對魚糜凝膠的幾種化學作用力的測定

魚糜凝膠在不同蛋白變性溶劑下溶解性的測定參照Hwang等[17]的方法，略有改動。稱取10 g的魚糜凝膠樣品，加入50 mL 0.6 mol/L NaCl（S1）溶液，利用組織搗碎機搗碎（15 000 r/min）2 min，離心（15 000×g，4 ℃）30 min后，采用考馬斯亮藍試劑盒測定上清液的蛋白質(zhì)含量；在沉淀部分中加入50 mL 0.6 mol/L NaCl＋1 mol/L尿素（S2）溶液，同樣通過搗碎、離心后，測定魚糜凝膠在S2溶液中的蛋白質(zhì)溶解性。根據(jù)上述方法，測定魚糜凝膠在0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（S3）溶液和0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/L β-巰基乙醇（S4）溶液中的蛋白質(zhì)溶解性。S4溶液都不溶解的沉淀部分則通過凱氏定氮法測定魚糜凝膠的不溶性蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶的影響

自溶指組織細胞失去生活機能，因受內(nèi)源酶的作用而發(fā)生的組織溶解。魚肉中的組織蛋白酶極易引起自溶現(xiàn)象，而組織蛋白酶對環(huán)境溫度變化極為敏感，因此溫度對魚肉自溶速率影響較大[18]。

圖1為草魚魚糜肌原纖維蛋白在不同溫度下自溶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）圖譜，隨著溫度升高，草魚魚糜肌原纖維蛋白重鏈（main heavy chain，MHC）含量也出現(xiàn)變化，這與魚糜內(nèi)源性組織蛋白酶活性大小隨溫度變化有關，魚糜內(nèi)源性組織蛋白酶活性越大，MHC的降解速率越快，自溶速率則越快。當溫度達到65 ℃時，MHC降解最為嚴重，自溶速率最大。超過65 ℃后，組織蛋白酶活性逐漸降低，MHC含量逐漸升高。圖1表明草魚魚糜最佳自溶溫度為65 ℃，因此在魚糜的實際生產(chǎn)中為了避免魚糜凝膠劣化，通常采用兩段加熱法以迅速通過最佳自溶溫度達到提升魚糜品質(zhì)的目的[19]。

圖1 不同溫度對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶影響的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE pattern showing the effect of temperature on grass carp surimi myofibril protein autolysis

2.2 不同pH值對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶的影響

有研究者已從魚肉中分離出了8 種組織蛋白酶，它們分別是A、B1、B2、C、D、E、H和L，它們最適活性的pH值均偏酸性，其中組織蛋白酶B最適活性pH值范圍為5.0～6.0，組織蛋白酶L最適活性的pH值范圍為3.0～6.5[20]。

由圖2可知，pH值低于6.5時，魚糜MHC自溶不明顯，在pH值為6.5處，MHC含量明顯減少，自溶速率達到最大；pH值大于6.5時，自溶仍然較明顯，但速率低于pH 6.5處。圖2表明，pH值為6.5時草魚內(nèi)源性組織蛋白酶活性最大，最易導致草魚魚糜自溶。

圖2 不同pH值對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶影響的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern showing the effect of pH on grass carp surimi myofibril protein autolysis

2.3 不同輔料對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶的影響

圖3為在最佳自溶溫度和pH值條件下，不同糖類輔料對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶的影響，其中對照組魚糜中MHC幾乎完全降解，1～6號組魚糜MHC則均保留了一部分，這是由于對照組魚糜中所含的內(nèi)源性組織蛋白酶在最佳自溶條件下容易將MHC降解，而輔料對魚糜的內(nèi)源性組織蛋白酶活性有抑制作用，且不同輔料的抑制效果也不相同。1～6號組中MHC含量較多的為1、2號和4號，表明抑制自溶效果較好的糖類輔料為馬鈴薯淀粉、蔗糖＋山梨醇和紫山藥。

圖3 不同糖類輔料對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶影響的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE pattern showing the effect of different saccharide additives on myofibril protein autolysis of grass carp surimi

圖4所示為在最佳自溶溫度和pH值條件下，不同蛋白類輔料對草魚魚糜MHC自溶影響的SDS-PAGE圖，對照組中MHC經(jīng)過90 min的自溶反應幾乎完全降解，而加入蛋白類輔料的魚糜中MHC均未完全降解，表明蛋白類輔料對魚糜內(nèi)源組織蛋白酶有抑制作用。由圖4可知，根據(jù)魚糜MHC含量大小可得出對魚糜內(nèi)源組織蛋白酶抑制的強弱順序依次為：膠原蛋白＞乳清蛋白＞大豆蛋白＞魚頭酶解物。

圖4 不同蛋白類輔料對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶影響的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE pattern showing the effect of different protein additives on myofibril protein autolysis of grass carp surimi

2.4 加入輔料后不同時間對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶的影響

圖5為在最佳自溶溫度和pH值條件下，加入馬鈴薯淀粉（圖5a）和膠原蛋白（圖5b）后草魚魚糜MHC經(jīng)過不同時間自溶的電泳圖譜。圖5a所示為加入3%馬鈴薯淀粉后魚糜MHC在120 min內(nèi)降解變化電泳圖譜，隨著時間延長，魚糜MHC含量迅速降低，經(jīng)過120 min自溶后，魚糜MHC已經(jīng)完全降解，這是由于馬鈴薯淀粉對魚糜組織蛋白酶的抑制效果不佳，魚糜MHC在120 min內(nèi)被迅速降解。圖5b所示為加入3%膠原蛋白后魚糜MHC在120 min內(nèi)降解情況，隨著時間延長，魚糜MHC逐漸降解，其速率較為緩慢，經(jīng)過120 min自溶后，魚糜MHC仍有一部分未被降解，這與膠原蛋白對魚糜組織蛋白酶的抑制效果較好有關，它延緩了魚糜MHC被降解的速率。

比較圖5a和圖5b可知，馬鈴薯淀粉和膠原蛋白均能抑制草魚魚糜內(nèi)源組織蛋白酶部分活性，不同的輔料對魚糜內(nèi)源組織蛋白酶抑制效果不同，本實驗發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的抑制效果好于馬鈴薯淀粉。

圖5 加入輔料后不同時間對草魚魚糜肌原纖維蛋白自溶影響的SDS-PAGE圖PAGEFig.5 SDS-PAGE patterns showing myofibril protein autolysis of grass carp surimi at different time points after individual addition of potato starch and collagen

2.5 加入輔料后經(jīng)過不同自溶時間對草魚魚糜凝膠強度的影響

魚糜凝膠強度構(gòu)成的主要因素是魚糜肌原纖維蛋白之間形成的三維結(jié)構(gòu)，因此魚糜肌原纖維蛋白含量在一定程度上能夠體現(xiàn)魚糜的凝膠強度。有研究表明，輔料能夠改善魚糜制品品質(zhì)，主要原因有兩個：一是輔料作為填充物能起到固定魚糜蛋白間交聯(lián)結(jié)構(gòu)的作用，從而提升魚糜凝膠強度以及應變力[9-10]；二是輔料中含有可與魚肉中的蛋白酶爭奪活性位點的物質(zhì)，抑制蛋白酶活性，因此可有效抑制魚糜制品的自溶[9]。

圖6為草魚魚糜對照以及分別加入3%馬鈴薯淀粉和3%膠原蛋白后，置于65 ℃和 pH 6.5條件下，經(jīng)過不同時間自溶后凝膠強度的變化情況。從圖中變化趨勢可以看出，3 組魚糜凝膠強度均隨著自溶時間延長而降低，這是由于魚糜中含有的內(nèi)源性組織蛋白酶對魚糜肌原纖維蛋白MHC進行不斷降解，減少了肌原纖維蛋白的數(shù)量，降低了魚糜凝膠強度。

0 min時，即自溶前，加入馬鈴薯淀粉的魚糜凝膠強度最大，其次為含膠原蛋白的魚糜，未添加輔料的魚糜凝膠強度最弱，表明馬鈴薯淀粉和膠原蛋白均能與魚糜蛋白產(chǎn)生一定的填充能力，且馬鈴薯淀粉對魚糜蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的填充能力強于膠原蛋白。

在0～30 min時間段內(nèi)3 組魚糜凝膠強度下降速率顯著，30 min時，加入3%馬鈴薯淀粉的魚糜凝膠強度小于含3%膠原蛋白的魚糜，這是由于馬鈴薯淀粉組自溶程度大于膠原蛋白組，表明膠原蛋白對魚糜組織蛋白酶的抑制效果好于馬鈴薯淀粉。

30～120 min時間段內(nèi)加入輔料的兩組魚糜凝膠強度下降并不顯著，對照組則在60～90 min時間段內(nèi)出現(xiàn)顯著下降。經(jīng)過120 min自溶后，3 組魚糜凝膠強度強弱順序依次為：膠原蛋白組＞馬鈴薯淀粉組＞對照組。

圖6 不同自溶時間對草魚魚糜凝膠強度的影響Fig.6 Effect of different autolysis time on the gel strength of grass carp surimi

2.6 不同輔料對魚糜凝膠形成作用力的影響

在魚糜凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中，蛋白之間的相互作用主要通過離子鍵、氫鍵、疏水性相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵等化學結(jié)合力進行維持[17]。0.6 mol/L NaCl（S1）溶液可以切斷魚糜蛋白之間的離子鍵結(jié)合，0.6 mol/L NaCl＋1 mol/L 尿素（S2）溶液可以切斷離子鍵結(jié)合和氫鍵結(jié)合，0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（S3）溶液可以切斷疏水性相互作用，0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/L β-巰基乙醇（S4）溶液甚至能切斷二硫鍵，因此魚糜凝膠蛋白在S1、S2、S3和S4溶液中的溶解率分別表示了蛋白之間的離子鍵、氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵等化學作用力的比例[21]。為了闡明膠原蛋白和馬鈴薯淀粉對魚糜凝膠中蛋白質(zhì)之間化學結(jié)合力的影響，利用各種蛋白變性劑測定了魚糜凝膠的溶解性。

圖7 不同輔料對草魚魚糜凝膠化學作用力的影響Fig.7 Effect of different additive agents on chemical interactions in grass carp surimi

圖7為10 g魚糜在S1、S2、S3和S4溶液中蛋白質(zhì)溶解程度，它反映了加入不同輔料對魚糜蛋白的4 種化學作用力的影響?？擅黠@看出無論有無輔料加入，S3溶解的蛋白均最多，表明魚糜蛋白間起主要作用的化學鍵為疏水相互作用，這與Benjakul[22]和劉海梅[23]等認為的疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵是維持魚糜凝膠穩(wěn)定構(gòu)象的主要化學作用力有一定差異。當加入3%膠原蛋白后S1和S4溶解的蛋白增加，而S2和S3溶解的蛋白減少，表明膠原蛋白促進了魚糜蛋白間離子鍵和二硫鍵的作用，同時減弱了氫鍵和疏水相互作用。當加入3%馬鈴薯淀粉后，S1溶解蛋白增多，S2、S3和S4溶解的蛋白稍有減少，S4溶解的蛋白含量無顯著變化，表明馬鈴薯淀粉增加了魚糜蛋白間的離子鍵，減少了氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用。

通過上述研究進一步表明，輔料加入魚糜后能夠使魚糜蛋白間的相互作用力產(chǎn)生變化，導致魚糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了魚糜制品的品質(zhì)。

3 結(jié) 論

草魚魚糜蛋白在不同溫度和pH值條件下自溶的SDS-PAGE圖表明草魚魚糜蛋白自溶最適溫度和pH值分別為65 ℃和6.5。

草魚魚糜蛋白經(jīng)過不同時間自溶后的SDS-PAGE圖以及魚糜凝膠強度的結(jié)果表明馬鈴薯淀粉對魚糜蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的填充能力強于膠原蛋白，而膠原蛋白對魚糜組織蛋白酶的抑制效果好于馬鈴薯淀粉。

草魚魚糜加入輔料前后的4 種化學作用力的變化結(jié)果表明膠原蛋白促進了魚糜蛋白間離子鍵和二硫鍵的作用，同時減弱了氫鍵和疏水相互作用，而馬鈴薯淀粉增加了魚糜蛋白間的離子鍵，減少了氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用。因此，輔料的加入能夠使魚糜蛋白間的離子鍵、氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵等化學作用力產(chǎn)生變化，導致魚糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了魚糜制品的品質(zhì)。

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Mechanism of Additive Agents for Improving Gel Performance of Grass Carp Surimi

YUAN Meilan， CHEN Lili， WU Runfeng， ZHAO Li*， ZHANG Yanan， WEI Lili
(National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing， School of Life Science，Jiangxi Science and Technology Normal University， Nanchang 330013， China)

In this study， the mechanism for improving the performance of grass carp surimi gel with additive agents was studied through gel electrophoresis， texture profile analysis and chemical reaction of surimi gel. The results showed that the optimal temperature and pH for grass carp surimi autolysis were 65 ℃ and 6.5， respectively. The filling ability of potato starch in cross-linking structure of surimi protein was higher than in that of collagen， while collagen had higher inhibition on cathepsin than potato starch did. The additive agents improved the quality of surimi through changing ionic bonds， hydrogen bonds， hydrophobic interactions and disulfide bonds in surimi.

grass carp surimi; additive agents; autolysis; surimi quality

TS254.4

A

1002-6630（2015）09-0044-05

10.7506/spkx1002-6630-201509009

2014-07-23

江西省高等學?？萍悸涞赜媱濏椖浚↘JLD12009）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（贛財教指2013258）

袁美蘭（1978—），女，副教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：yuanmimi@163.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：lizhao618@hotmail.com