崔月倩，王菁蕊，王艷萍

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

乳酸菌基因表達(dá)載體及其應(yīng)用研究進(jìn)展

崔月倩，王菁蕊，王艷萍*>

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

近年來隨著乳酸菌的功能特性和應(yīng)用研究的深入，利用分子手段研究乳酸菌的功能基因已經(jīng)成為最新 研究熱點(diǎn)。研究者構(gòu)建眾多不同特性的基 因表達(dá)載體，本文從載體使用的安全性角度對已經(jīng)報(bào)道的載體進(jìn)行總結(jié)，并介紹各類基因表達(dá)載體在發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖、酶制劑、疫苗制備等方面的應(yīng)用。

乳酸菌；非食品級基因表達(dá)載體；食品級基因表達(dá)載體；應(yīng)用

乳酸菌屬革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，是一類可以利用發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類菌的總稱，包括腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等眾多種屬[1-2]，被廣泛地應(yīng)用于食品發(fā)酵、醫(yī)藥生產(chǎn)、保健藥物及飼料添加劑等工業(yè)。對乳酸菌的研究已經(jīng)由傳統(tǒng)的菌株篩選、功能特性 及其應(yīng)用，深入到各種功能的分子機(jī)制以及乳酸菌作為食品及生物制品的載體等方面，乳酸菌的分子生物學(xué)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。早在20世紀(jì)80年代初，乳酸菌的遺傳特性開始被國內(nèi)外專家學(xué)者所關(guān)注。隨后相繼研發(fā)了一系列的基因表達(dá)載體和模式菌株。

近年來，研究者從不同的應(yīng)用角度構(gòu)建了大量的乳酸菌基因表達(dá)載體。就乳酸菌的應(yīng)用特性而言，乳酸菌表達(dá)載體主要分為兩類：非食品級乳酸菌表達(dá)載體以及食品級乳酸菌表達(dá)載體，這也是乳酸菌非常獨(dú)特的區(qū)別于其他模式生物的特點(diǎn)之一。本文就乳酸菌中基因表達(dá)載體及其應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 非食品級基因表達(dá)載體

20世紀(jì)80年代初，乳酸菌被國內(nèi)外專家學(xué)者關(guān)注，展開了乳酸菌遺傳系統(tǒng)的研究，這對乳酸菌的工業(yè)化應(yīng)用以及對菌株的改造有重要意義。在乳酸菌的分子遺傳特性研究過程中，為了選擇合適的轉(zhuǎn)化子，對特定菌株進(jìn)行篩選，通常將一個(gè)或多個(gè)編碼抗性篩選標(biāo)記的基因與載體進(jìn)行連接，從而達(dá)到篩選重組菌株的目的。其中常見的抗性篩選標(biāo)記基因有紅霉素、氯霉素等抗性基因。

1.1 帶有紅霉素抗性標(biāo)記的載體

紅霉素是糖多孢紅霉菌（Saccharopolyspora erythraea）合成的次級代謝產(chǎn)物，目前廣泛應(yīng)用于臨床及作為分子生物學(xué)的篩選標(biāo)記，其對革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌作用。自從Thompson等[3]克隆出紅霉素抗性基因ermE后，該基因廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建（表1）。例如：van de Guchte等[4]構(gòu)建的3.6 kb大小的大腸桿菌-乳酸菌多宿主穿梭載體pMG36e，攜帶來自于質(zhì)粒pE194的紅霉素抗性基因EryR、大腸桿菌的強(qiáng)啟動(dòng)子P32、pWV01質(zhì)粒的復(fù)制子以及多克隆位點(diǎn)，以及乳酸乳球菌乳脂亞種蛋白酶基因（prtP）的轉(zhuǎn)錄終止子，目前是乳酸菌中最常用的載體之一。由Kleerebezem[5]及van de Guchte[4]等構(gòu)建的乳酸菌-大腸桿菌多宿主穿梭載體pNZ9520、pNZ9530，由低拷貝質(zhì)粒pAMβ1和pIL253衍生，以ermE作為篩選標(biāo)記，攜帶來自pAMβ1的rep啟動(dòng)子以及pIL253的nisR和nisK基因，是近年來乳鏈球菌素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)（nisin controlled gene expression system，NICE）中乳酸乳球菌基因表達(dá)研究的代表。此外，還有一系列攜帶了紅霉素篩選標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體。如，Bryan等[6]構(gòu)建的pMSP3535載體，van Kranenburg等[7]構(gòu)建的pNZ4055表達(dá)載體等。

表1 攜帶紅霉素基因EryR篩選標(biāo)記的常見乳酸菌基因表達(dá)載體Table 1 Gene expression withEErryyRin lactic acid bacteriaa

1.2 帶有氯霉素抗性標(biāo)記的載體

由于氯霉素可以增加低拷貝質(zhì)粒的拷貝數(shù)，提高質(zhì)粒的得率，因此在大多數(shù)構(gòu)建的乳酸菌表達(dá)載體中，均選用了氯霉素作為抗性篩選標(biāo)記。常用的pNZ系列質(zhì)粒大都采用了氯霉素抗性篩選標(biāo)記（表2）。例如：由pNZ123以及pNZ273質(zhì)粒衍生的以Lactococcus lactis NZ9000/NZ9100為宿主菌株的pNZ8008載體[8]，含有CmR抗性基因，攜帶有g(shù)usA基因，來源于pSH71質(zhì)粒的復(fù)制子。由此基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建的pNZ8037[8]及pNZ8048[9]載體，也是標(biāo)準(zhǔn)的乳酸乳球菌表達(dá)載體，編碼CmR抗性基因，攜帶cat基因，復(fù)制子來源于pSH71質(zhì)粒，并攜帶有Nisin誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PnisA，可以在大腸桿菌和乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)。以pNZ8048為基礎(chǔ)載體構(gòu)建的pNZ8148[10]及pNZ8150[10]載體均攜帶了CmR抗性基因，克服了pNZ8048載體低水平 表達(dá)的缺點(diǎn)，在乳酸菌內(nèi)高效表達(dá)。除上述載體外，還有其他由基礎(chǔ)載體構(gòu)建的克隆表達(dá)載體，例如：Platteeuw等[11]構(gòu)建的pNZ2102、pNZ2103載體也攜帶了氯霉素抗性篩選標(biāo)記，陳家锃等[12]以pPG612為基礎(chǔ)載體構(gòu)建的SlpA-612載體。

表2 以氯霉素為抗性篩選標(biāo)記（編碼CmR抗性基因）的常見乳酸菌基因表達(dá)載體Table 2 Gene expression with CCmmRin lactic acid bacteriaa

乳酸菌表達(dá)載體除了以紅霉素和氯霉素作為篩選標(biāo)記外，卡那霉素和氨芐青霉素等抗生素也可被用來作為篩選標(biāo)記。

2 食品級表達(dá)載體

目前，分子克隆的載體系統(tǒng)大多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的選擇標(biāo)記，而抗性基因容易向環(huán)境中漂移擴(kuò)散，對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，且不能直接用于人和動(dòng)物，對生物體易造成不可估量的危害。乳酸菌作為益生菌的主要來源，一般認(rèn)為是安全的食品級微生物（generally recognized as safe，GRAS），它的應(yīng)用也是和食品密切相關(guān)。隨著人們對食品安全問題日益重視，眾多學(xué)者一直致力于高 效、無毒副作用的乳酸菌表達(dá)載體的研究。在食品中應(yīng)用的基因表達(dá)載體，需要滿足以下條件：1）轉(zhuǎn)化載體的宿主菌必須是食品級微生物。食品級微生物，遺傳特性清楚，且能穩(wěn)定遺傳。乳酸乳球菌和植物乳桿菌等食品級乳酸菌由于其安全無毒的特性，已經(jīng)在食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。2）乳酸菌基因載體必須是食品級。為了進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建的眾多載體均帶有抗性基因標(biāo)記，在食品中存在抗性基因標(biāo)記會對人體和環(huán)境帶來的一定的安全隱患，所以在食品中必須選用含有食品級篩選標(biāo)記的載體來進(jìn)行選擇。3）乳酸菌使用的誘導(dǎo)物必須是食品級。在乳酸菌的克隆表達(dá)過程中，需要一定的誘導(dǎo)物。在食品表達(dá)系統(tǒng)中，要求誘導(dǎo)物必須是食品級，為人類可食用，例如：乳糖、蔗糖、Nisin等。

2.1 食品級表達(dá)系統(tǒng)

在食品級乳酸菌 中已經(jīng)形成了一系列適合乳酸菌的基因表達(dá)系統(tǒng)，例如：糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，噬菌體Φ31爆發(fā)式誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)、乳鏈球菌素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)、pH值調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)[13]等。

2.1.1 糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

乳酸菌基因組中含有糖代謝相關(guān)基因簇，在以各種糖類為碳源的培養(yǎng)基上生長。在乳酸菌的糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，主要應(yīng)用的是糖類選擇標(biāo)記。糖類作為食品級誘導(dǎo)物，可以作為非抗生素抗性的選擇標(biāo)記進(jìn)行應(yīng)用。大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)使用乳糖作為選擇標(biāo)記來誘導(dǎo)基因表達(dá)。在乳糖選擇系統(tǒng)中，將糖類篩選標(biāo)記進(jìn)行克隆，構(gòu)建食品級載體（表3）。例如：以L. lactis NZ3900為宿主菌的食品級乳酸菌表達(dá)載體pNZ8149[8]，大小為2.5 kb，在NcoⅠ位點(diǎn)后攜帶有Nisin誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PnisA，并含有l(wèi)acF基因，以乳糖為選擇標(biāo)記，通過乳糖進(jìn)行篩選。以L. casei為宿主菌的食品級質(zhì)粒pLEB590[14]和pLEB600[15]均由L. lactis DNA構(gòu)成，攜帶pSH71復(fù)制子以及repA基因，分別攜帶P45以及PpepR啟動(dòng)子，且含有l(wèi)acG基因，利用乳糖選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，此外，pLEB590還攜帶Nisin結(jié)構(gòu)基因-nisI基因。

此外，還有木糖、蔗糖等選擇標(biāo)記。以D-木糖作為選擇性標(biāo)記的大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭載體pLP3537[16]進(jìn)行了戊糖乳桿菌染色體上的木糖還原酶基因簇xyl的克隆與表達(dá)。此乳酸菌表達(dá)載體由L. pentosus MD353中1.7 kb和2.3 kb的質(zhì)粒構(gòu)成，攜帶有XylR、XylA以及XylB以及來自于pUC19的復(fù)制子。Leenho uts等[17]利用乳酸菌的整合構(gòu)建了以蔗糖為選擇標(biāo)記的食品級表達(dá)系統(tǒng)，將編碼蔗糖和蔗糖水解酶的基因scrA/scrB克隆進(jìn)乳球菌質(zhì)粒pWV01中，利用此質(zhì)粒的拷貝（Ori+）以及L. lactis DNA在L. lactis LL108及L. lactis LL102菌種中進(jìn)行構(gòu)建，成功構(gòu)建了以蔗糖為篩選標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體pINT124、pINT125。Mahmoud等[18]利用此表達(dá)載體在乳酸乳球菌中表達(dá)了細(xì)菌素基因pctA。

表3 糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的常見乳酸菌基因表達(dá)載體Table 3 Gene expression vectors in sugar inducible expression system

2.1.2 乳鏈球菌素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)

在乳鏈球菌素調(diào)控 表達(dá)系統(tǒng)中，應(yīng)用了細(xì)菌素抗性選擇標(biāo)記。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的一種具有抗菌特性的蛋白質(zhì)，菌體本身對細(xì)菌素具有免疫性[19]。常用的食品級細(xì)菌素為乳鏈球菌素，又名乳鏈菌肽（Nisin），此食品級誘導(dǎo)物控制的基因表達(dá)系統(tǒng)為NICE基因表達(dá)系統(tǒng)，是由de Ruyter等[8]構(gòu)建的。它是以Nisin生物合成基因簇（包括結(jié)構(gòu)基因nisA）的啟動(dòng)子PnisA和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因nisRK為基礎(chǔ)，由Nisin誘導(dǎo)而自我調(diào)節(jié)的系統(tǒng)。Nisin可以在含有nisRK基因的宿主菌中高效誘導(dǎo)表達(dá)，在PnisA后插入外源基因，研究證明利用Nisin控制的基因表達(dá)（nisin controlled gene expression system，NICE）系統(tǒng)在乳酸菌中表達(dá)異源蛋白，誘導(dǎo)效率可超過1 000 倍以上[9]。許多乳酸菌菌株因含有Nisin抗性基因，構(gòu)建基因載體便可以此基因?yàn)榭剐赃x擇標(biāo)記。目前，已構(gòu)建了大量含有Nisin抗性基因的載體（見表2、3）。van de Guchte等[4]構(gòu)建的含有EryR的多宿主菌株表達(dá)載體pNZ9530運(yùn)載nisR和nisK基因，在乳鏈菌肽誘導(dǎo)下表達(dá)雙質(zhì)粒系統(tǒng)。此外，由pNZ123、 pNZ273和pSH71等基礎(chǔ)載體演變而來的含有CmR的乳酸菌表達(dá)載體pNZ8008[8]、pNZ8037[8]、pNZ8048[10]、pNZ8148[10]和pNZ8150[10]等均含有nisA基因，含有Nisin誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PnisA，在Nisin的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。de Ruyter等[8]構(gòu)建的大小為2.5 kb的pNZ8149食品級表達(dá)載體以Lactococcus lactis NZ3900為宿主菌，在NcoⅠ位點(diǎn)含有一個(gè)nisA基因，以及由Nisin誘導(dǎo)的PnisA，并運(yùn)載 repA、repC基因及l(fā)acF基因。L. lactisNZ3900/ pNZ8149系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑、篩選物和宿主都是食品級，符合美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）安全標(biāo)準(zhǔn)，該系統(tǒng)可作為理想的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)已經(jīng)表達(dá)了靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼基因LZ-8[20]。此外，Takala等[14]構(gòu)建的以乳酸乳球菌MG1614為宿主菌的pLEB590食品級表達(dá)載體，運(yùn)載nisI基因，由乳球菌DNA，pSH71復(fù)制子和用于nisI表達(dá)的組成型啟動(dòng)子P45組成。上述載體均已經(jīng)成功的應(yīng)用在NICE基因表達(dá)系統(tǒng)中。

2.1.3 噬菌體Φ31爆發(fā)式誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)

在乳酸菌的噬菌體誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，通過Φ31侵染后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。此系統(tǒng)中應(yīng)用的表達(dá)載體pTRK391，是由LacZ基因以及Φ31啟動(dòng)子P8625構(gòu)成，構(gòu)建載體后侵染乳酸菌菌株，構(gòu)建噬菌體誘導(dǎo)系統(tǒng)，啟動(dòng)蛋白的高效表達(dá)，但是會促進(jìn)乳酸菌宿主菌的裂解，因此噬菌體表達(dá)系統(tǒng)并沒有被廣泛應(yīng)用[16-21]。

2.1.4 pH值調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)

Madsen等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)了受pH值 調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子P170，構(gòu)建了表達(dá)載體pAMJ529、pAMJ536和pAMJ547，轉(zhuǎn) 化后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，菌株能夠生長，當(dāng)上調(diào)至7.0時(shí)表達(dá)受到抑制，停止生長。通過調(diào)節(jié)不同的pH值，進(jìn)行調(diào)控系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2 營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記

此種選擇標(biāo)記是將某些表型基因進(jìn)行突變或缺失，整合到質(zhì)粒中，再整合入互補(bǔ)的表型，進(jìn)行篩選（表4）。Dickely等[23]構(gòu)建的乳酸菌表達(dá)載體pFG1，以赭石型突變抑制基因supB作為選擇標(biāo)記，進(jìn)行克隆表達(dá)。Sorensen等[24]等用琥珀型突變抑制基因supD構(gòu)建了可抑制嘧啶營養(yǎng)缺陷的載體pFG200載體。此外，王春鳳[25]構(gòu)建的以胸苷酸合成酶基因thyA作為篩選標(biāo)記的非抗性重組質(zhì)粒表達(dá)載體pW425t，以及孫強(qiáng)正等[26]構(gòu)建的食品級分泌型表達(dá)載體pSQZ，以thyA為選擇標(biāo)記，表達(dá)出有保護(hù)活性的蛋白。質(zhì)粒pW425t和pSQZ是由以乳酸乳球菌MBP71為宿主菌的以thyA為選擇標(biāo)記的質(zhì)粒pSH91構(gòu)建而來。

表4 以營養(yǎng)缺陷作為篩選標(biāo)記的常見的乳酸菌基因表達(dá)載體Table 4 Gene expression with nutrient deficiency in lactic acid bacteria

3 乳酸菌表達(dá)載體的應(yīng)用

乳酸菌是人體內(nèi)必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體腸道中，調(diào)節(jié)著人體的腸道健康，與人們的健康長壽有著直接關(guān)系。乳酸菌作為安全級食品菌株，通過對其深入研究，應(yīng)用乳酸菌基因表達(dá)載體構(gòu)建重組菌株，及其產(chǎn)生的大量酶、多肽、中間代謝物等表達(dá)產(chǎn)物，可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域，有巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價(jià)值。乳酸菌表達(dá)載體的廣泛應(yīng)用，提高了酶制劑、胞外多糖等代謝物質(zhì)的產(chǎn)量，對食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用。

3.1 在疫苗制備方面的應(yīng)用

近年來，對疫苗傳遞系統(tǒng)的研究過程中，人們期待找到一種能夠在體內(nèi)較長時(shí)間存在，而對機(jī)體本身既安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的傳遞載體。乳酸菌廣泛存在于人類與動(dòng)物腸道中，促使機(jī)體產(chǎn)生特異性或非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。近年來隨著乳酸菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)、電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)、食品級載體的發(fā)展，以乳酸菌作為研制載體疫苗成為可能[27]。目前已經(jīng)有利用乳酸菌研究研制疫苗的報(bào)道。Kajikawa等[28]利用表達(dá)載體pIGM2J在Lactobacillus casei中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功誘發(fā)細(xì)胞免疫因子的分泌，促進(jìn)了乳酸菌疫苗的成功應(yīng)用。Sung等[29]將構(gòu)建的載體pKV-Pald-PgsA-Amylase在乳酸菌中表達(dá)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）抗原蛋白，構(gòu)建重 組菌株，為制備子宮頸癌疫苗，治愈子宮頸癌提供了可能。此外，曲英敏等[30]利用大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體pW425et與腦膜炎奈瑟氏菌NspA基因進(jìn)行重組，構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白表達(dá)，表達(dá)蛋白能夠與腦膜炎奈瑟氏菌患者體內(nèi)的IgG特異性結(jié)合，推動(dòng)了研制抵抗腦膜炎奈瑟氏菌的乳酸菌免疫作用疫苗的發(fā)展。郭衍冰等[31]也利用此載體對新城疫病毒基因（HN）進(jìn)行了表達(dá)，為制備病毒口服疫苗提供了技術(shù)保障。夫廈玲[32]利用pKV-Pald-PgsA-E7（Rb）表達(dá)載體在乳酸菌內(nèi)表達(dá)，乳酸菌在其表面上表達(dá)HPV抗原蛋白E7（Rb），然后將其作為疫苗直接使用，通過在小鼠模型實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答，對患有宮頸癌的小鼠具有一定的效果。

3.2 在酶制劑制備中的應(yīng)用

近年來，通過將乳酸菌酶基因與質(zhì)粒連接構(gòu)建表達(dá)載體，在乳酸菌或外源菌株中進(jìn)行大量表達(dá)，成功制備各類酶制劑。van de Guchte等[4]在pMG36e載體構(gòu)建成功后，表達(dá)了溶菌酶基因，對溶菌酶的大量表達(dá)與制備提供了可行性?？芴锾颷33]在此質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，構(gòu)建了以紅色熒光蛋白基因?yàn)闃?biāo)記的乳酸菌融合表達(dá)系統(tǒng)pMG36e-dsred2，對α-淀粉酶基因 進(jìn)行了表達(dá)，能夠產(chǎn)生淀粉酶從而分解淀粉。Wang Lamei等[34]利用載體pNZ8149對硬脂酰-輔酶A脫氫酶基因scd1進(jìn)行表達(dá)，對功能性酶制劑的制備提供了美好前景。Sorensen等[24]構(gòu)建的食品級表達(dá)載體pFG200，在干酪乳桿菌中進(jìn)行了β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）的表達(dá)，以及進(jìn)行了蛋白酶基因pepN在工業(yè)乳酸乳球菌的克隆表達(dá)。此外，唐麗杰等[35]還利用了pPG612載體表達(dá)了豬乳鐵蛋白基因，為重組乳酸菌抗菌制劑的制備奠定了基礎(chǔ)。Li Bin等[36]利用載體pNZ8148將膽堿水解酶（bile salt hydrolase，BSH）基因轉(zhuǎn)入乳球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NZ9000中，為制備降膽固醇的酶制劑提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

3.3 在代謝產(chǎn)物調(diào)控方面的應(yīng)用

有不同的發(fā)酵特性及代謝產(chǎn)物，例如產(chǎn)胞外多糖。由于乳酸菌的安全性，因此其生產(chǎn)的胞外多糖可以應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域，且胞外多糖還具有抗腫瘤，免疫作用，對生物體具有良好的益生作用[37]。由于乳酸菌菌株產(chǎn)的胞外多糖產(chǎn)量較小，通過分子生物學(xué)手段使其高產(chǎn)胞外多糖，滿足食品工業(yè)的需求。Haywood等[38]將多糖代謝關(guān)鍵酶——α-磷酸葡萄糖變位酶基因pgm利用pT1NX表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到Lactobacillus casei BL310中，成功使胞外多糖產(chǎn)量增加了172%。van Kranenburg等[7]構(gòu)建的pNZ4055表達(dá)載體在產(chǎn)胞外多糖乳酸球菌中過量地表達(dá)eps-D基因（代謝關(guān)鍵酶——引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶），使胞外多糖產(chǎn)量提高15%。除胞外多糖外，還有乳酸以及類黃酮等代謝物的生產(chǎn)?？芴锾颷33]在質(zhì)粒pMG36e的基礎(chǔ)上構(gòu)建的pMG36e-dsred2基因工程菌，實(shí)現(xiàn)了一步法生產(chǎn)乳酸，提高了乳酸的產(chǎn)量。Schümann等[39]利用表達(dá)載體pSIP409將蘋果酸乳酸酶基因（mle）克隆到Lactobacillus plantarum WCFS1中，發(fā)現(xiàn)重組菌加速了乳酸的發(fā)酵。Liu Hongyu等[40]利用載體pNZ8149將大豆查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI1A）進(jìn)行克隆表達(dá)，為生產(chǎn)類黃酮奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 語

乳酸菌作為益生菌，其應(yīng)用前景巨大，早已涵蓋食品、醫(yī)療、養(yǎng)殖、環(huán)保、新材等多個(gè)領(lǐng)域，對有效抵抗腸道感染、抗腹瀉、調(diào)節(jié)胃腸道功能，減輕腹脹、腹瀉、便秘等起到了重要作用。但因其遺傳背景不清楚，應(yīng)用受到限制，通過抗性篩選載體對乳酸菌功能基因進(jìn)行研究，進(jìn)一步清晰其調(diào)控機(jī)理，在乳酸菌遺傳機(jī)制的調(diào)控以及對乳酸菌的改造方面具有推動(dòng)作用。乳酸菌抗性篩選載體構(gòu)建了大量的基因工程菌株，促進(jìn)了乳酸菌工業(yè)化的應(yīng)用進(jìn)展，通過基因的超表達(dá)，多肽、酶、多糖、細(xì)菌素等代謝物質(zhì)的產(chǎn)量提高，為制備酶制劑、乳酸菌口服疫苗提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

然而，乳酸菌抗性篩選載體在應(yīng)用的同時(shí)，因其攜帶的抗性篩選基因，對環(huán)境以及人體有害，雖然達(dá)到了篩選的目的，但在食品、疫苗等生產(chǎn)方面的應(yīng)用受到了一定程度的限制。因此，需要利用食品級、安全性高的篩選標(biāo)記代替抗性標(biāo)記，構(gòu)建食品級乳酸菌載體。食品級乳酸菌載體可以有效地應(yīng)用于乳酸菌食品、口服疫苗生產(chǎn)中，其安全、穩(wěn)定的特性為人們所重視，為人們所應(yīng)用。

綜上，乳酸菌表達(dá)載體的研究及應(yīng)用，對推動(dòng)乳酸菌的分子生物學(xué)研究起到關(guān)鍵作用。在乳酸菌構(gòu)建的表達(dá)載體中，含有抗性篩選標(biāo)記的表達(dá)載體雖不能應(yīng)用在食品中，但對于研究乳酸菌的遺傳背景做出了巨大的貢獻(xiàn)。食品級的乳酸菌表達(dá)載體無毒副作用，對利用分子手段改造乳酸菌菌株發(fā)揮了安全保證作用。乳酸菌基因表達(dá)載體已經(jīng)成功的應(yīng)用于酶、多肽、中間代謝物等表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)，對食品、醫(yī)藥、保健業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域大發(fā)展起到極大的推動(dòng)作用。在乳酸菌中還有許多隱蔽性質(zhì)粒存在，其具有巨大的應(yīng)用前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值，需要進(jìn)一步的深入研究。隨著乳酸菌分子生物學(xué)的發(fā)展，對乳酸菌基因工程菌株的利用與研發(fā)將對乳酸菌的深入研究和應(yīng)用發(fā)揮重要作用。

[1] 劉斌， 黃少磊， 劉彥民. 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌分類鑒定的研究進(jìn)展[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2012， 24(7): 670-673.

[2] KHALISANNI K. An overview of lactic acid bacteria[J]. International Journal of Biosciences， 2011， 1(3): 1-13.

[3] THOMPSON C J, KIESER T, WARD J M, et al. Physical analysis of antibiotic-resistance genes from Streptomyces and their use in vector construction[J]. Gene， 1982， 20(1): 51-62.

[4] van de GUCHTE M， van der VOSSEN J， KOK J， et al. Construction of a lactococcal expression vector: expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp. lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1989， 55(1): 224-228.

[5] KLEEREBEZEM M， BEERTHUYZEN M， VAUGHAN E E， et al. Controlled gene expression systems for lactic acid bacteria transferable nisin-inducible expression cassettes for Lactococcus， Leuconostoc， and Lactobacillus spp.[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1997，63(11): 4581-4584.

[6] BRYAN E M， BAE T， KLEEREBEZEM M. Improved vectors for nisin-controlled expression in gram-positive bacteria[J]. Plasmid，2000， 42(2): 183-190.

[7] van KRANENBURG R， vos HARMJAN R， van SWAMI I， et al. Functional analysis of glycosyl transferase genes from Lactococcus lactis and other gram-positive cocci: complementation， expression，and diversity[J]. Journal of Bacteriology， 1999， 181(20): 6347-6353.

[8] de RUYTER P G， KUIPERS O P， de vos WILLEM M. Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1996，62(10): 3662-3667.

[9] KUIPERS O P， de RUYTER P G， KLEEREBEZEM M， et al. Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria[J]. Journal of Bacteriology， 1998， 64(1): 15-21.

[10] MIERAU I， KLEEREBEZEM M. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2005， 68(6): 705-717.

[11] PLATTEEUW C, van ALEN-BOERRIGTER I, van SCHALKWIJK S. Food-grade cloning and expression system for La ctococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(3): 1008-1013.

[12] 陳家锃, 崔紅玉, 田志軍. 乳酸桿菌組成型啟動(dòng)子探測載體pgateway-612的構(gòu)建[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 33(11): 849-853.

[13] 王瑩， 胡桂學(xué). 食品級乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010， 37(7): 80-83.

[14] TAKALA T M， SARIS P E J. A food-grade cloning vector for lactic acid bacteria based on the nisin immunity gene nisI[J]. Applied Microbiology and Bi otechnology， 2002， 59(4): 467-471.

[15] TAKALA T M. Nisin immunity and food-grade transformation in lactic acid bacteria[D]. Finland: University of Helsinki， 2005.

[16] POSNO M， HEUVELMANS P T， van GIEZEN M J， et al. Complementation of the inability of Lactobacillus stains to utilize D-xylose with D-xylose catabolism-encoding genes of Lactobacillus pentosus[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1991， 57(9): 2764-2766.

[17] LEENHOUTS K， BOLHUIS A， VENEMA G， et al. Construction of a food-grade multiple-copy integration system for Lactococcus lactis[J]. App l ied Microbiology and Biotechnology， 1998， 49(1): 417-423.

[18] MAHMOUD K T， SAMEH E M. Heterologous expression of pctA gene expressing propionicin T1 by some lactic acid bacterial strains using pINT125[R]. Netherlands: Alexandria University， 2011.

[19] 張小美， 樓秀玉， 顧青. 1 株 產(chǎn) 細(xì)菌素乳酸菌的鑒定和細(xì)菌素的分離純化[J]. 中國食品學(xué)報(bào)， 2013， 13(12): 181-187.

[20] 曲寧寧， 陳萍， 孫鑫澤. 靈芝lz-8基因乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)及免疫特性[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 35(4): 411-415.

[21] WALKER S A， KLAENHAMMER T R. Molecular characterization of a phage inducible middle promoter and its transcriptional activator from the lactococcal bacteriophage Φ31[J]. Journal of Bacteriology，1998， 180(4): 921-930.

[22] MADSEN S M， ARNAU J， VRANG A， et al. Molecular chara cterization of the pH-inducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis[J]. Molecular Microbiology，1999， 32(1): 75-87.

[23] DICKELY F， NILSSON D， HANSEN B E, et al. Isolation of Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a food-grade cloning vector[J]. Mole cular Microbiology， 1995， 15(5): 839-847.

[24] SORENSEN K I， LARSEN R， KIBENICH A， et al. A food-grade cloning system for industrial strains of Lactococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2000， 66(4): 1253-1258.

[25] 王春鳳. 共生乳酸桿菌非抗性表達(dá)載體的構(gòu)建及柔嫩艾美耳球蟲SO7基因的表達(dá)[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2001.

[26] 孫強(qiáng)正， 熊衍文， 葉長蕓. 食品級分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及報(bào)告蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2008， 48(3): 293-298.

[27] 孟慶峰， 徐展， 王偉利. 活載體疫苗的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013(10): 28-31.

[28] KAJIKAWA A， MASUDA K， KATOH M， et al. Adjuvant effects for oral immunization provided by recombinant Lactobacillus casei secreting biologically active murine interleukin-1βΔ[J]. American Society for Micro biology， 2010， 17(1): 43-48.

[29] SUNG M H， POO H Y， LEE I H， et al. Stable constitutively high expression vector for preparing HPV vaccine and recombinant lactic acid bacteria transformed thereby: US， 8685721[P]. 2014-04-01.

[30] 曲英敏， 李艷艷， 李景梅. 腦膜炎奈瑟氏菌NspA基因重組乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33(4): 439-442.

[31] 郭衍冰， 胡靜濤， 于丹. 重組NDVHN 基因乳酸菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 35(2): 184-187.

[32] 夫廈玲. 用于制備HPV疫苗和由其轉(zhuǎn)化的重組乳酸菌的穩(wěn)定組成型高表達(dá)載體: 中國， 000126[P]. 2010-01-08.

[33] 寇田田. 乳酸菌融合表達(dá)載體的構(gòu)建及α-淀粉酶基因的克隆與表達(dá)[D].保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[34] WANG Lamei， LI Shili， GOU Kemian， et al. Heterologous expression of stearoyl-CoA desaturase-1 in Lactococcus lactis NZ3900[J]. Chinese Journal of Biotechnology， 2012， 28(9): 1106-1117.

[35] 唐麗杰， 哈卓， 趙麗麗. 豬乳鐵蛋白基因的克隆及其重組乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 41(3): 79-84.

[36] LI Bin， JIANG Yujun. Cloning of bile salt hydrolase gene and its expression in lactic acid b a cteria[J]. Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)， 2011， 18(2): 48-53.

[37] 王艷萍， 李超， AHMED Z. 一株馬乳酒樣乳桿菌胞外多糖的理化性質(zhì)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2011， 37(9): 59-63.

[38] SANF?LIX-HAYWOOD N， COLL-MARQU?S J M， YEBRA M J. Role of α-phosphoglucomutase and phosphoglucose isomerase activities at the branching point between sugar catabolism and anabolism in Lactobacillus casei[J]. Journal of Applied Microbiology，2011， 111(2): 433-442.

[39] SCH?MANN C， MICHLMAYR H， EDER R， et al. Heterologous expression of Oenococcus oeni malola ctic enzyme in Lactobacillus plantarum for improved malolactic fermentation[J]. AMB Express，2012， 2(1): 19. doi: 10.1186/2191-0855-2-19.

[40] LIU Hongyu， WANG Piyu， FU Yongping. Cloning of tap Ⅱ chalcone i somerases (CHI1A) gene and construction of Lactococcus lactis expression vector[J]. Journal of Agricultural Science and Technology，2010， 11(4): 44-46.

A Review of Research on Lactic Acid Bacteria Vectors for Gene Expression and Their Applications

CUI Yueqian， WANG Jingrui， WANG Yanping*
(College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China)

In recent years， with the further functional study on the characteristics and applications of lactic acid bacteria， molecular biology of lactic acid bacteria is also of concern. Cloning and functional expression of lactic acid bacteria using molecular tools have become the latest hotspot. Researchers have found or built many gene expression vectors wit h different characteristics which lay the foundation for gene cloning and expression of lactic acid bacteria. Based on the characteristics of lactic acid bacteria， this paper summarizes the vectors which have been reported from the perspective of safety. And we also review the applications of gene expression vectors for the production of polysaccharides， enzyme and vaccine preparation， etc.

lactic acid bacteria; non-food-grade genetic expression vector; food-grade genetic expression vector; application

Q782

A

1002-6630（2015）09-0224-06

10.7506/spkx1002-6630-201509042

2014-08-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171629）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101218）；中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014M551029）

崔月倩（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：cuiyueqian@163.com

*通信作者：王艷萍（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：ypwang@tust.edu.cn