劉鮮鮮，王君瑋，王 娟，趙建梅，蓋文燕，孫佳怡，鄒 明，黃秀梅，曲志娜

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

山東部分生豬屠宰場屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況分析

劉鮮鮮1，2，王君瑋1，王 娟1，趙建梅1，蓋文燕1，孫佳怡2，鄒 明2，黃秀梅1，曲志娜1

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

[目的] 初步調(diào)查分析山東部分地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況和血清型分布，了解生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌的動(dòng)態(tài)變化。[方法] 采集魯東部、東北部、中部、西部和西南部地區(qū)不同規(guī)模屠宰場生豬屠宰環(huán)節(jié)樣品共1012份，分離疑似沙門氏菌并利用PCR方法和血清凝集反應(yīng)進(jìn)行鑒定，單因子血清進(jìn)一步進(jìn)行血清型分析。[結(jié)果] 共分離鑒定沙門氏菌202株；魯東、東北、中部、西部和西南部地區(qū)的沙門氏菌污染率分別為27.2%、12.6%、34.6%、12%和13.5%；沙門氏菌分離株共有9種血清型，以德爾卑（S.derby）、鼠傷寒（S.typhimurium）、湯卜遜（S.thompson）為主。[結(jié)論] 山東地區(qū)部分屠宰場生豬屠宰環(huán)節(jié)存在較嚴(yán)重的沙門氏菌污染現(xiàn)象，應(yīng)加強(qiáng)屠宰環(huán)節(jié)致病菌監(jiān)測，并在屠宰全程嚴(yán)格執(zhí)行良好生產(chǎn)規(guī)范。

沙門氏菌；生豬；屠宰環(huán)節(jié)；血清型；細(xì)菌污染

沙門氏菌（Salmonella）是腸桿菌科最常見的人畜共患病原菌之一。沙門氏菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜，目前為止已鑒定的血清型達(dá)2500多種，我國已檢出290多種[1]，且新的血清型仍不斷被發(fā)現(xiàn)。人感染沙門氏菌多由鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等常見的幾種沙門氏菌血清型引起，也有一些食源性疾病由德爾卑沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌等引起。

目前，由沙門氏菌引起的食物中毒事件位居世界前列[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起，其中90%以上的沙門氏菌感染都是由肉類動(dòng)物性食品引起，而豬肉已被認(rèn)定為人感染沙門氏菌的主要來源之一[3]。本研究旨在對(duì)山東地區(qū)部分生豬屠宰企業(yè)屠宰環(huán)節(jié)中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定，對(duì)鑒定菌株進(jìn)行血清型分布分析，以便了解本地區(qū)屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌的污染狀況和優(yōu)勢血清型分布，為進(jìn)一步開展沙門氏菌分子流行病學(xué)分析、污染肉品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及制定控制規(guī)范提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。2014年3月至12月，自山東部分地區(qū)不同規(guī)模生豬屠宰場主要屠宰環(huán)節(jié)采集的樣品，共1012份。其中，魯東部地區(qū)305份，東北部地區(qū)182份，中部地區(qū)133份，魯西和西南地區(qū)分別為192份和200份。樣品采集、標(biāo)記后，放入運(yùn)輸培養(yǎng)基，冷藏送至實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.1.2 對(duì)照菌株。腸炎沙門氏菌CICC21482為陽性對(duì)照菌株，大腸桿菌ATCC25922為陰性對(duì)照菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 陽性血清。沙門氏菌屬O抗原診斷血清、分型血清，購自泰國S&A公司。

1.1.4 主要試劑。緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（法國博賽科瑪嘉）、胰蛋白大豆肉湯、細(xì)菌瓊脂粉、MH肉湯，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司。GoTaq Green Master Mix 酶、DNA Marker DL1000、PCR反應(yīng)試劑，購自Takara。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)。吸取100μL樣品接入BPW預(yù)增菌液中，置37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8～12h。然后，吸取200μL預(yù)增菌液接入現(xiàn)配制的TTB增菌液中，42℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。取增菌液適量接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后，挑取紫色和類似紫色的可疑單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接種至胰蛋白大豆胨肉湯中純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆胨平板，37℃培養(yǎng)18～24h，備用。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[4]發(fā)表的沙門氏菌保守基因invA引物序列，用primer5.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增大小約284 bp的基因片段。上游引物（P1）：5’-GTGAAATTATCG CCACGTTCGGGCAA-3’；下游引物（P2）：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.2.2 PCR鑒定 采用熱裂解法[5]提取細(xì)菌DNA。反應(yīng)體系為25μL：Green mix 12.5μL，去離子水 9.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，64℃30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳成像后，觀察結(jié)果。

1.2.2.3 血清學(xué)鑒定 按照文獻(xiàn)[6]中的方法和產(chǎn)品說明書，用沙門氏菌屬O抗原診斷血清對(duì)PCR鑒定陽性的沙門氏菌分離株進(jìn)一步進(jìn)行確定，同時(shí)用生理鹽水作對(duì)照。被A～F多價(jià)O血清凝集的菌株，進(jìn)一步用O型單因子血清作玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行分型確定。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌分離與培養(yǎng)

分離菌株在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上為紫色或淡紫色，胰蛋白大豆胨平板上為白色光滑菌落。革蘭氏染色結(jié)果為陰性短桿菌。初步判定為疑似沙門氏菌菌株，需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定分析。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

PCR檢測結(jié)果表明：提取分離純培養(yǎng)的202株疑似沙門氏菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1.2%

瓊脂糖凝膠電泳成像，均出現(xiàn)284bp大小的目的片段。部分代表性菌株P(guān)CR電泳條帶見圖1。PCR陽性菌落進(jìn)一步用沙門氏菌O抗原診斷學(xué)清確證，均出現(xiàn)凝集。

圖1 沙門氏菌invA基因 PCR檢測結(jié)果

2.3 血清型分型

對(duì)202株經(jīng)PCR鑒定和多價(jià)O血清確定為陽性的菌株，利用沙門氏菌單因子血清進(jìn)行血清分型。結(jié)果共鑒定出9種血清型。檢出率較高的3種主要血清型分別為德爾卑沙門氏菌（S.derby）（n=80）、鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）（n=56）、湯卜遜沙門氏菌（S.thompson）（n=34）。不同地區(qū)優(yōu)勢血清型差異較大。其中，魯東部地區(qū)屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌優(yōu)勢血清型依次為S.typhimurium（n=32）、S.derby（n=11）、S.agona（n=2）、S.enteritidis（n=1）；西部地區(qū)優(yōu)勢血清型除S.typhimurium（n=19）、S.derby（n=6）外，S.tsevie（n=2）、S.agona（n=1）、S.lagos（n=1）和S.oritamerin（n=1）也有分布；東北部地區(qū)以S.derby（n=26）為主，其次為S.lomita（n=2）和S.typhimurium（n=4）；中部地區(qū)以S.thompson（n=31）為優(yōu)勢血清型，而西南部地區(qū)的沙門氏菌優(yōu)勢血清型為S.derby（n=34）。除上述定型菌株外，還有10株沙門氏菌不能定型。

2.4 沙門氏菌污染狀況統(tǒng)計(jì)分析

山東地區(qū)部分屠宰場生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌總體污染率為19.8%（202/1021）。不同地區(qū)沙門氏菌的污染有較大差異，其中，魯中部地區(qū)污染檢出率最高（34.6%），西部和東北及西南地區(qū)相對(duì)較低（圖2）。

圖2 山東省內(nèi)不同地區(qū)屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染比較

在進(jìn)入屠宰流程后的不同采樣環(huán)節(jié)中，除魯東部和中部地區(qū)有較大差別外，其他三個(gè)地區(qū)的淋浴后體表至出庫前肉表面以及剝皮、劈半工具上沙門氏菌污染差異不明顯。采樣的5個(gè)地區(qū)生豬肛門拭子沙門氏菌檢出率差異較大，分別為10%～50%。不同環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況見圖3。

圖3 山東部分地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況比較

3 討論

生豬屠宰環(huán)節(jié)是肉品受致病菌污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)之一。本研究自2014年3月至12月間從魯東部地區(qū)采樣305份，分離出沙門氏菌83株，分離率為27.2%；魯東北部地區(qū)采樣182份，分離出沙門氏菌23株，分離率為12.6%；魯中部地區(qū)采樣133

份，分離出沙門氏菌46株，分離率高達(dá)34.6%；魯西部地區(qū)采樣192份，分離沙門氏菌23株，分離率為12.0%；西南部地區(qū)采樣200份，分離沙門氏菌27株，分離率為13.5%。共采集樣品1012份，分離出沙門氏菌202株，總分離率為19.8%。從屠宰環(huán)節(jié)污染檢出情況看，與李郁[7]對(duì)合肥五個(gè)定點(diǎn)生豬屠宰場進(jìn)行的沙門氏菌污染狀況調(diào)查較接近，500份生豬體表樣本及200份胴體肉樣中沙門氏菌檢出率分別為24.2%和17%。而普遍高于侯小剛等[8]對(duì)四川省豬肉生產(chǎn)鏈中屠宰場胴體肉樣進(jìn)行的沙門氏菌污染狀況調(diào)查結(jié)果（胴體污染率為10.71%）。說明盡管由于屠宰場規(guī)模、環(huán)境、日屠宰量以及屠宰人員等因素不同，不同區(qū)域不同屠宰場的污染率有差異，但屠宰環(huán)節(jié)存在沙門氏菌污染現(xiàn)象不容忽視。

由于不同地區(qū)不同規(guī)模的生豬屠宰場的主要環(huán)節(jié)有所不同，采樣時(shí)共有的主要屠宰環(huán)節(jié)統(tǒng)一采樣10份，且肛門拭子按照屠宰場的日屠宰量不同按比例采樣。剝皮后沖洗水、劈半后沖洗水、去蹄刀具、開膛工具、燙洗水、屠宰場墻壁等由于不同屠宰場采樣流程不同，為方便敘述統(tǒng)一歸為其它環(huán)節(jié)。從本研究結(jié)果看，2014年度選取的魯東、魯東北、魯中、魯西和魯西南地區(qū)生豬屠宰場屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌的污染率較高，不同屠宰環(huán)節(jié)的污染率也存在一定差異。與豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中其他環(huán)節(jié)如豬養(yǎng)殖場、銷售市場的沙門氏菌污染率相比，也有很大的差異。張瑋等[9]對(duì)安徽部分豬場生豬調(diào)查的結(jié)果表明沙門氏菌檢出率為4.07%，其中安慶地區(qū)豬場檢出率達(dá)到18.89%。與侯小剛等[8]四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈研究發(fā)現(xiàn)屠宰場和銷售市場豬肉沙門氏菌污染率分別為10.71%和10%相近，高于張靜[10]等對(duì)某定點(diǎn)生豬屠宰場的研究中豬胴體體表5%的分離率。

生豬屠宰不同環(huán)節(jié)沙門氏菌的污染率不同，肛門拭子、脫毛后胴體表面、剝皮后胴體表面、劈半前后胴體表面以及剝皮工具的污染率較其他環(huán)節(jié)高，分別為29.3%、46%、48%、32%、40%、32%。肛門拭子沙門氏菌大多為生豬本身帶有或從待宰圈及運(yùn)輸車等感染或污染。攜帶率較高則可能造成在屠宰過程中污染其他健康豬只，造成嚴(yán)重的交叉污染現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)剝皮后胴體表面的沙門氏菌污染率最高，且比剝皮前沙門氏菌的污染率高出22%，加之剝皮工具也具有較高的污染率，分析原因可能為由剝皮工具消毒次數(shù)較少或一些小規(guī)模的屠宰場根本就不消毒而造成的嚴(yán)重污染。不同地區(qū)，由于屠宰環(huán)境、日屠宰量、屠宰場規(guī)模的不同，每個(gè)屠宰環(huán)節(jié)的沙門氏菌污染率也有所不同，魯東北、西部和西南部地區(qū)由于屠宰場規(guī)模差異不大，日屠宰量較接近以及屠宰人員流動(dòng)性小，屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌的污染狀況相似。魯東部和中部地區(qū)由于生豬屠宰量較大，生豬屠宰場較多且分布集中，所選取的生豬屠宰場規(guī)模大小相似，屠宰量較少，因而沙門氏菌分離率高于其他地區(qū)。相同屠宰環(huán)節(jié)的分離率也高于其他地區(qū)。

從血清型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果看，分離株血清型以德爾卑沙門氏菌為主，占所檢測沙門氏菌總數(shù)的39.6%，與楊寶偉等[11]的研究結(jié)果相似。魯東部和西部地區(qū)以鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，東北部和西南部地區(qū)優(yōu)勢血清型為德爾卑沙門氏菌，而中部地區(qū)以湯卜遜沙門氏菌為主，未分離出其他血清型，與西南部地區(qū)僅分離出德爾卑沙門氏菌結(jié)果相似，分析原因可能為采集樣品的屠宰場環(huán)境相似，屠宰場相對(duì)集中或者是待宰豬只來源地相同造成。而魯西地區(qū)分離出6種血清型，分離出血清型種類最多，分析原因可能為屠宰場距離遠(yuǎn)、較分散，豬只來源地不同所引起。同時(shí)不同屠宰環(huán)節(jié)的血清型大致相同，提示本地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)存在交叉污染現(xiàn)象。

沙門氏菌食物中毒是全球最常見的食源性疾病之一。了解生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況不僅能及時(shí)掌握區(qū)域內(nèi)的沙門氏菌分布、血清型流行差異，而且對(duì)豬源沙門氏菌監(jiān)測、對(duì)沙門氏菌在生豬屠宰環(huán)節(jié)中的流行病學(xué)調(diào)查具有十分重要的意義。本研究的初步調(diào)查研究結(jié)果也為今后生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染的調(diào)查、污染狀況風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1]邵坤. 山東省食源性沙門氏菌監(jiān)測及分型研究[D]. 濟(jì)南：

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Analysis on Salmonella Contamination Status during Pig Slaughtering in Shandong Province

Liu Xianxian1，2，Wang Junwei1，Wang Juan1，Zhao Jianmei1，Gai Wenyan1，Sun Jiayi2，Zou Ming2，Huang Xiumei1，Qu Zhina1
（1.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Animal Products of Ministry of Agriculture，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong province 266032；2.Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong province 266109）

[Objective] To investigate Salmonella contamination status of during pig slaughtering in Shandong province and understand the dynamic trend of Salmonella in pig slaughtering. [Method] 1012 samples were gathered during pig slaughtering at different level from east，north-east，middle，west and south-west of Shandong province in 2014. Salmonella strains were isolated and identifi ed by PCR and serum agglutination test and their serotypes were further analyzed with the O type serum to Salmonella. [Result] 202 Salmonella strains were isolated. The isolation rate in the east，north-east，middle，west and south-west parts of Shandong Province was 27.2%，12.6%，34.6%，12% and 13.5%，respectively. There were 9 Salmonella serotypes. S.derby，S.typhimurium and S.thompson were the dominant serotypes in this area. [Conclusion] Heavy Salmonella contaminations were observed during pig slaughtering in each slaughterhouse in Shandong province. Salmonella strains isolated had diverse phenotypes. Cross contamination of Salmonella existed in all steps of pig slaughtering.

Salmonella; pig; slaughtering; serotype; bacteria contamination

508；R387.22

B

1005-944X（2015）05-0082-05

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專項(xiàng)（2014）（GJFP2014007）

王君瑋