葉榮蘋 李晟 施翔翔 劉偉 肖建新

2型糖尿病女性人群AMPKα2基因多態(tài)性與冠心病及脂聯(lián)素 抵抗素的關(guān)系

葉榮蘋 李晟 施翔翔 劉偉 肖建新

目的 探討2型糖尿病（T2DM）女性患者AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–AD）的相關(guān)性，及與脂聯(lián)素、抵抗素的關(guān)系。方法 收集40例CAD合并T2DM女性患者（CAD+DM組）和45例T2DM女性患者（DM組），利用聚合酶鏈限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）及基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)AMPKα2基因多態(tài)性。并通過酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定血清脂聯(lián)素、抵抗素濃度。結(jié)果 兩組間AMPKα2基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.50，P=0.04），GG基因型為CAD+DM發(fā)病的保護(hù)因素（OR為0.33，95% C.I.為0.13～0.81; χ2=5.95；P=0.02），AMPKα2基因多態(tài)性與脂聯(lián)素、抵抗素及低密度脂蛋白水平明顯相關(guān)。結(jié)論 T2DM女性患者AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）與CAD及脂聯(lián)素、抵抗素水平具有相關(guān)性。

腺苷酸活化蛋白激酶 基因多態(tài)性 冠心病 脂聯(lián)素 抵抗素

糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。88%的糖尿病和代謝綜合征患者其超聲心動(dòng)圖顯示頸動(dòng)脈有動(dòng)脈粥樣硬化征象。脂聯(lián)素、抵抗素是近年來發(fā)現(xiàn)的新型脂肪細(xì)胞分泌的肽類激素［1］，國(guó)內(nèi)研究［2］證實(shí)AMPKα2 基因（rs2796516）與脂聯(lián)素存在關(guān)聯(lián)性，因此，AMPKα2基因多態(tài)性可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–AD）風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本文探討T2DM女性患者rs2796516基因多態(tài)性與CAD及脂聯(lián)素、抵抗素水平的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年5月因胸痛在中國(guó)解放軍第118醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科住院的T2DM女性患者85例，并根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查（CAG）或64層螺旋CT冠狀動(dòng)脈成像，確定冠狀動(dòng)脈狹窄。分為冠心病合并糖尿病組（CAD+DM組）40例，經(jīng)CAG證實(shí)存在至少一支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%，年齡49～88歲，平均（55.3±16.12）歲。單純糖尿病組（DM組）45例，經(jīng)CAG或64層螺旋CT冠狀動(dòng)脈成像證實(shí)無冠狀動(dòng)脈狹窄或狹窄程度＜50%，年齡43～81歲，平均（51.64±14.37）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）吸煙患者。（2）急、慢性感染者。（3）近期有創(chuàng)傷、手術(shù)或血管重建患者。（4）甲狀腺功能異常。（5）全身免疫性疾病。（6）3個(gè)月內(nèi)曾出現(xiàn)心肌梗死、中風(fēng)或短暫性腦缺血（TIA）發(fā)作。（7）紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心力衰竭分級(jí)Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)。（8）肝臟疾病。（9）嚴(yán)重腎功能不全。（10）惡性腫瘤患者。兩組對(duì)象均為無血緣關(guān)系的散發(fā)人群，本項(xiàng)目得到各醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料獲取 問卷內(nèi)容包括一般情況、健康相關(guān)行為、飲酒、吸煙、飲食習(xí)慣、運(yùn)動(dòng)情況、疾病史、并進(jìn)行體格檢查、包括身高、體重、血壓等。入院次日清晨空腹行血生化、FPG、血脂、糖化血紅蛋白等檢查。采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測(cè)定血清脂聯(lián)素和抵抗素水平，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說明書（上海華舜生物工程有限公司）進(jìn)行。

1.3 AMPKα2基因型檢測(cè) 所有受檢者均晨空腹抽取外周靜脈血2ml，采用DNA試劑盒提取人類白細(xì)胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆??；蛞飬⒖嘉墨I(xiàn)［3］上游引物: 5’-CAT AGA TTA GCA GCA TTG AAA GC-3’，下游引物: 5’-AATACA CCC ACC AGA ATA GCA CA-3’。行直接測(cè)序方法，讀取個(gè)體的基因型。見圖1、2、3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件分析等位基因和基因型頻率與CAD的關(guān)聯(lián)性。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性，基因型及等位基因頻率的比較行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SNP rs2796516測(cè)序AA基因型

圖2 SNP rs2796516測(cè)序AG基因型

圖3 SNP rs2796516測(cè)序GG基因型

2 結(jié)果

2.1 CAD+DM組與DM組各觀察指標(biāo)比較 兩組年齡、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、TG、TC、FPG、HDL-C、糖化血紅蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CAD+DM組BMI、LDL-C、抵抗素均高于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而脂聯(lián)素較DM組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CAD+DM組與DM組各觀察指標(biāo)比較（x±s）

2.2 CAD+DM組與DM組AMPKα2基因多態(tài)性比較 基因型頻率在兩組間AMPKα2基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.50，P=0.04）；CAD+DM組和DM組G型等位基因頻率分別為64%和83%，兩組間等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.04，P=0.01）。GG基因型為CAD+DM發(fā)病的保護(hù)因素（OR為0.33，95% C.I.為0.13～0.81; χ2=5.95；P=0.02）見表2。

表2 CAD+DM組與DM組AMPK2基因多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率分布

2.3 Hardy-Weinberg 平衡分析 CAD+DM組χ2=3.52；P=0.06，DM組χ2=3.53；P=0.06，可以認(rèn)為兩組趨向于遺傳平衡。見表3。

表3 CAD+DM組與DM組AMPKα2基因多態(tài)性基因型Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

2.4 不同AMPKα2基因型的血清脂聯(lián)素及抵抗素水平比較 脂聯(lián)素水平比較，GG基因型脂聯(lián)素水平較GA及AA基因型高，GA基因型脂聯(lián)素水平較AA基因型高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。抵抗素水平比較，GG基因型抵抗素水平較GA及AA基因型低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LDL-C水平比較，GG及GA基因型LDL-C水平均較AA基因型低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余指標(biāo)各基因型組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 不同AMPKα2基因型的血清脂聯(lián)素、抵抗素水平比較（x±s）

3 討論

本資料通過控制兩組間多個(gè)危險(xiǎn)因素及觀察指標(biāo)，如高血壓，血糖差異。CAD+DM組BMI、LDL-C、抵抗素均明顯高于DM組（P＜0.05），而脂聯(lián)素較DM組明顯降低。其次，通過兩組AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）等位基因頻率比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G型等位基因頻率分別為64%和83%，頻率明顯低于DM組（P＜0.05），表明該位點(diǎn)G型等位基因可能減少冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR=0.39而CHD+DM和DM組基因型比較，GG基因型分別為48%和73%，頻率明顯低于DM組（P＜0.05），且GG基因型OR=0.33，提示該基因型可減少冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，由此可得出結(jié)論，AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）與冠心病感性有一定的相關(guān)性。

已有資料報(bào)道［2］，甘肅地區(qū)漢族人群AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）與T2DM及血清脂聯(lián)素、抵抗素水平有明顯相關(guān)性。Spencer-Jones等［3］通過對(duì)2777例高加索地區(qū)健康女性進(jìn)行了PRKAA2基因篩選（rs1124900，rs2796516，rs2746342，rs2796498，rsl41844），顯示rs2796516與甘油三酯，ApoB及中心性肥胖顯著相關(guān)。本資料結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，本資料所有對(duì)象均為浙南地區(qū)T2DM女性人群，并控制血壓，吸煙等血管危險(xiǎn)因素，所有研究對(duì)象不同基因型之間脂聯(lián)素、抵抗素及LDL-C水平比較，結(jié)果顯示，GG等位基因的脂聯(lián)素水平高于GA及AA基因型，而抵抗素及LCL-C水平顯著低于GA及AA基因型，考慮為rs2796516位點(diǎn)A型等位基因可以通過增加胰島素抵抗的趨勢(shì)［4］，并使胰島β細(xì)胞分泌功能下降，從而影響AMPK通路，導(dǎo)致血脂代謝異常，使脂聯(lián)素水平降低，抵抗素及LCL-C水平上升，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化過程［5］。本研究推測(cè)AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）可能機(jī)制為AA基因型轉(zhuǎn)錄活性較GA及GG型低。在缺血缺氧及再灌注等條件下，尤以心肌細(xì)胞及腦組織細(xì)胞的能量消耗以及氧消耗最大，AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）A等位基因的突變可能導(dǎo)致AMPK對(duì)下游蛋白激酶的磷酸化的調(diào)控減低［6］，血管內(nèi)皮細(xì)胞及周圍組織細(xì)胞因ATP減少引起內(nèi)環(huán)境的改變，并使原有的抑制能量消耗負(fù)反饋途徑激活不全。從而導(dǎo)致血管（冠狀動(dòng)脈）內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

本研究通過比較CAD合并T2DM患者與2型糖尿病人群的AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）比較，結(jié)果提示浙南地區(qū)2型糖尿病人群中AMPKα2基因多態(tài)性（rs2796516）與冠心病發(fā)生存在一定的相關(guān)性，本研究樣本量仍偏小，結(jié)果仍有待擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。

1 Kawanami D, Maemura K, Takeda N,et al. Direct reciprocal effects of resistin and adiponectin on vascular endothelial cells: a new insight into adipocytokine-endothelial cell interactions. Biochem Biophys Res Commun. 2004,314(2):415～419.

2 劉婧星,任建功,孫保生,等. AMPKα2基因多態(tài)性與2型糖尿病及脂聯(lián)素、抵抗素的關(guān)系.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,3(12)1366～1370

3 Speneer-Jones NJ,Ge D,Snieder H,et al. AMP-kinase alpha 2 subunit gene PRKAA2 variants are associated with totaled cholesterol,lowdensity lipoprotein-cholesterol and high-density lipoproteincholesterol in normal women. J Med Genet,2006,43(12):936～942.

4 Kuang X,Yan M,Ajmo JM,et al. Activation of AMP-activated protein kinase in cerebella of Atm-mice is attributable to accumulation of reactive oxygen species.Biochem Biophys Res Commun,2012,418(2):267～272.

5 Wallace BK,Foroutan S,O'Donnell ME. Ischemia-induced stimulation of Na-K-Cl cotransport in cerebral microvascular endothelial cells involves AMP kinase.Am J Physiol Cell Physiol,2011,301(2):316～326.

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Objective The aim of this study was to investigate the possible role of AMPKα2 gene（rs11549467）variant in the development of coronary artery disease in women with type 2 diabetics（T2DM），adiponectin and resistin. Methods We analyzed 40 coronary artery disease in women with T2DM patients and 45 T2DM controls using polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）and sequence-based typing developed in our laboratory. ELISA technique was employed to determine the plasma adiponectin and resistin concentration. Results The AMPKα2 gene（rs11549467）variant was found to be signifi cantly associated with coronary artery disease（χ2=6.50 P=0.04）The individuals with the GG genotype showed statistically signifi cant increased risk for coronary artery disease（OR=0.33，95% C.I.=0.13-0.81; χ2=5.95；P=0.02）. AMPKα2 variant was significantly related to blood lipid and the concentration of plasma adiponectin and resistin.Conclusion The AMPKα2 gene（rs11549467）variant may be a genetic risk factor for developing coronary artery disease in women with T2DM. Whereas the AMPKα2 gene（rs11549467）variant was revelant with T2DM，the concentration of plasma adiponectin and resistin.

AMP-activated protein kinase（AMPK） Gene polymorphism Coronary artery disease Resistin Adiponectin

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20130363）

325000 解放軍第118醫(yī)院心血管內(nèi)科（葉榮蘋 李晟 劉偉 肖建新）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科（施翔翔）