禹思宇，周 宇，唐連飛，孟 芳，袁曉芬，梁 斌

（1.湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，湖南長沙 410004；2.惠州出入境檢驗檢疫局，廣東惠州 516006）

分子信標(biāo)熒光定量PCR檢測H3N2亞型豬流感病毒方法的建立

禹思宇1，周 宇2，唐連飛1，孟 芳1，袁曉芬1，梁 斌1

（1.湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，湖南長沙 410004；2.惠州出入境檢驗檢疫局，廣東惠州 516006）

利用新型熒光探針—分子信標(biāo)，建立一種檢測豬流感病毒的新方法。根據(jù)H3N2亞型豬流感病毒（SIV）的HA和NA基因的保守基因序列，分別設(shè)計并合成了特異性引物和分子信標(biāo)探針，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測H3N2亞型SIV。構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK-H3和pSK-N2并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，該檢測方法的敏感性達(dá)到102拷貝/μL；與其它主要相關(guān)病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間試驗的重復(fù)性變異系數(shù)（CV）均小于3%，表明該方法靈敏度強(qiáng)、特異性好。此方法的建立將為流感病毒H3N2亞型定型檢測提供一種快速有效的方法。

豬流感病毒；H3N2亞型；分子信標(biāo)探針；實(shí)時熒光定量PCR

豬流感病毒（swine infl uenza virus，SIV）是豬群中一種可引起急性高度接觸傳染性呼吸道疾病的A型流感病毒[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感病毒的HA有16個亞型，NA有9個亞型，已從豬體內(nèi)分離到H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H5N2和H9N2 等11種不同亞型的SIV[2]。我國豬群中主要以H3N2和H1N1亞型的流行和危害比較嚴(yán)重[3]。豬是人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的共同宿主，流感病毒可能在豬體內(nèi)發(fā)生基因重組或重配，產(chǎn)生新的病毒株，造成新的流行；豬在流感病毒的病原學(xué)、生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)中占有重要地位，對豬流感的快速診斷必將成為預(yù)測和防止流感大暴發(fā)的重要手段。

要實(shí)現(xiàn)對H3N2流感的快速診斷，最快捷可行的方式是檢測病毒核酸，目前使用最多的是熒光定量PCR方法。本試驗使用的分子信標(biāo)探針，不同于一般的探針。分子信標(biāo)是設(shè)計最為巧妙的一種新型熒光分子探針，具有高選擇性、高靈敏度和背景干擾低等優(yōu)越性[4-6]，在檢測快速變異的病毒時非常有優(yōu)勢，在病毒分型時也是功能強(qiáng)大的工具。不同亞型的豬流感病毒，致病性差異很大，使用傳統(tǒng)方法或不能快速、準(zhǔn)確的檢測出疫病，或無法對病毒進(jìn)行分型。本實(shí)驗結(jié)合分子信標(biāo)技術(shù)建立豬H3N2流感的熒光定量PCR方法，對流感病毒進(jìn)行快速檢測并分型。采用該技術(shù)，即使出現(xiàn)新的變異毒株，通過改變分子信標(biāo)探針，即可對新的流感毒株進(jìn)行識別，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 毒株與核酸樣品

H3N2型豬流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；H1、H5、H9亞型豬流感病毒、豬圓環(huán)病毒II型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）核酸由本實(shí)驗室保存。

1.2 主要試劑

熒光定量試劑盒、RNA抽提試劑盒，購自Promega公司；pMD18-T、反轉(zhuǎn)錄用M-MLV、感受態(tài)細(xì)胞JM109試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司；RNA抽提Trizol試劑，購自Invitrogen公司；HiScribe T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自NEB公司；商品化H3N2豬流感熒光PCR檢測試劑盒，購自圣湘生物。

1.3 引物和探針的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的H3N2亞型SIV的HA、NA基因核苷酸序列，利用DNA Star軟件進(jìn)行同源性分析比較，選出高度保守且特異的核苷酸區(qū)域，用軟件Beacon Designer 7設(shè)計2對特異性引物H3F、H3R、N2F、N2R和2個特異分子信標(biāo)探針H3P、N2P，引物和探針由上海閃晶生物技術(shù)公司合成，探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM和HEX，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為4（二甲基對胺基偶氮苯）苯甲酸（DABCYL），具體見表1。

表1 引物和探針序列

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

按照RNA提取試劑盒說明書提取H3N2 SIV的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA用于試驗，將擴(kuò)增后H3N2的HA基因和NA基因分別克隆至pBlueScriptSK（-）構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測定。將正確的質(zhì)粒分別命名為pSK-H3和pSK-N2。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和敏感性試驗

在260 nm與280 nm波長下測定質(zhì)粒的含量，并根據(jù)公式計算每微升液體中質(zhì)粒的拷貝數(shù)。以重組質(zhì)粒為模板，按照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書轉(zhuǎn)錄合成RNA。反轉(zhuǎn)錄后用無菌水10倍系列稀釋（109拷貝/μL～l02拷貝/μL）后根據(jù)優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和敏感性試驗。

1.6 特異性及重復(fù)性試驗

將H3N2與H1、H5、H9 亞型SIV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV、PRRSV進(jìn)行特異性試驗，以確定該方法的特異性。取4個濃度的樣品（108拷貝/μL、107拷貝/μL、106拷貝/μL、105拷貝/μL）作為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗，每個濃度設(shè)4個重復(fù)，分成3個批次（A、B、C），進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。

1.7 臨床樣品的檢測

對本實(shí)驗室所保存疑似豬流感101份樣品，利用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 含H3HA 及N2NA基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

H3N2 RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增H3N2的HA和NA基因目的片段。結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的片段分別約100bp和80bp，大小與預(yù)期相符。將其克隆于pBlueScriptSK（-）中構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK-H3和pSK-N2，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。并以EcoR I將該重組質(zhì)粒線性化，通過體外轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)T7 RNA聚合酶制備HA和NA基因片段的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用于熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

圖1 H3HA和N2NA基因的PCR 擴(kuò)增

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件的確定

熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL，其中2x qPCR buffer 12.5μL，上下游引物（10pmol/μL）各0.5μL，探針（10pmol/μL）1μL，cDNA 1μL，DEPC水補(bǔ)足25μL。將該體系瞬時離心后，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，擴(kuò)增45個循環(huán)。擴(kuò)增過程中收集熒光信號。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性

將兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)T7體外轉(zhuǎn)錄及反轉(zhuǎn)錄后所得cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見圖2。從左到右的反應(yīng)模板依次為1×109～1×102拷貝/μL，在濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，陰性對照無擴(kuò)增反應(yīng)。以起始模板的對數(shù)為x軸，Ct值為Y軸做回歸曲線，即得到H3N2檢測的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。斜率為-3.534（H3）、-3.349（N2），截距為46.04（H3）、41.26（N2），效率為1.918（H3）、1.989（N2），從而可以得出拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：Ct（H3）= -3.534×lg（拷貝數(shù)）+ 46.04和Ct（N2）= -3.349×lg（拷貝數(shù)）+ 41.26，而將待測樣品的Ct值代入表達(dá)式就可以計算出它的初始拷貝數(shù)，也可直接從儀器上讀取。敏感性試驗顯示最低檢出量為102拷貝/μL。

圖2 熒光定量PCR 的動力學(xué)曲線

2.4 特異性、重復(fù)性試驗

特異性：除H3N2亞型SIV外，H1、H5、H9亞型SIV與其他豬病病毒檢測結(jié)果均為陰性（見圖4）。表明建立的熒光定量PCR診斷方法特異性強(qiáng)。熒光定量PCR批內(nèi)和批間重復(fù)試驗結(jié)果見表2、3，批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)（CV）為0.1%-0.35%，批間重復(fù)試驗CV為0.39%-1.57%，兩者CV值均在3%以下，表明該方法穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

圖3 熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 SIV H3（A）、N2（B）基因熒光定量PCR 檢測的特異性試驗結(jié)果

表2 SIV H3基因重復(fù)性試驗結(jié)果

表3 SIV N2基因重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

對實(shí)驗室所保存的101份豬流感疑似樣品，用建立的熒光定量PCR方法和試劑盒方法（圣湘生物）進(jìn)行檢測，兩者符合率為100%。

3 討論

豬流感主要造成急性上呼吸道感染，臨床癥狀為體溫突然升高（40～45℃），豬流感有時還會出現(xiàn)流產(chǎn)。豬流感可繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染，嚴(yán)重時可導(dǎo)致呼吸衰竭[7]。此外，豬流感病毒也是豬免疫抑制的主要誘因之一，豬群感染豬流感病毒可引起豬繁殖能力減退，育肥豬增重減慢等[8]。豬流感不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，還對人類健康造成威脅，因此研究快速、敏感、準(zhǔn)確的豬流感診斷產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和公共衛(wèi)生意義。本試驗結(jié)合ROCHE480 熒光定量檢測系統(tǒng)，運(yùn)用分子信標(biāo)技術(shù)建立了一種新的SIV定量檢測方法，通過測定SIV的核苷酸拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測SIV的目的。

目前，分子信標(biāo)技術(shù)已應(yīng)用于SNPs分析、基因定量分析、疾病基因檢測與診斷等生物領(lǐng)域，Bauerfeind等[9]利用分子信標(biāo)技術(shù)對綿羊、山羊和牛的副結(jié)核分枝桿菌做了分子鑒定；John等通過分子信標(biāo)檢測豬病病原體，證明了該方法比常規(guī)PCR具有更高的敏感性。[10]分子信標(biāo)作為一種新型熒光分子探針設(shè)計十分巧妙，探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和淬滅分子，在目標(biāo)物不存在時探針以莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在。探針的5'端和3'端自身可形成一種6個堿基左右的莖部結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子之間發(fā)生熒光共振能量傳遞（FRET），因此不會產(chǎn)生熒

光。在其環(huán)狀部分，一般是一段長度為15～30堿基的序列，能與目標(biāo)分子特異結(jié)合。當(dāng)溶液中有特異性PCR發(fā)生時，探針與模板雜交，從而破壞了探針的FRET，于是便產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與溶液中模板量成正比，因此可用于PCR定量分析[11]；發(fā)夾結(jié)構(gòu)保證了分子信標(biāo)的高選擇性，只有完全互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA分子才能引起分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)完全打開，從而發(fā)出熒光，因此它所具有的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)越性；由于采用的非熒光染料作為淬滅分子，因此熒光本底比較低，有效的降低了背景干擾。

本文設(shè)計選擇了2個分子信標(biāo)探針，即H3-P（針對SIVHA基因）、N2-P（針對SIV NA基因）。在熒光定量PCR反應(yīng)過程中以兩種熒光通道信號分別追蹤同一樣品RNA的HA基因和NA基因的擴(kuò)增動力學(xué)變化，實(shí)驗結(jié)束即可確定其中病毒RNA的含量，又可以確定該病毒的亞型，檢測過程方便、快捷。國內(nèi)有過有關(guān)H3N2豬流感熒光PCR方法的報道，陳艷等[2]采用的是TaqMan MGB 探針法檢測H3N2，TaqMan探針由于采用熒光和淬滅基團(tuán)雙末端標(biāo)記，因此淬滅難以徹底，本底較高。報告基團(tuán)的水解利用的是Taq酶的5'-3'外切活性，因此定量時容易受酶活性影響。探針標(biāo)記成本較高，不便普及應(yīng)用[12]；孫忠晟[13]針對H3N2亞型流感病毒HA基因建立了SYBR Green I熒光RT-PCR檢測方法，SYBR Green I 檢測本身特異性差，不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號，所以在低樣本濃度時，不能進(jìn)行基因突變分析，且靈敏度低，適合于5 000拷貝以上的基因定量[14]。本實(shí)驗結(jié)合分子信標(biāo)技術(shù)建立豬H3N2流感的熒光定量PCR方法，定量不受酶的影響，高特異性，高靈敏度，一次實(shí)驗即可確定病毒的亞型。

此外，以往建立的檢測RNA病毒的熒光定量PCR方法，均使用含有目的基因的質(zhì)粒，即DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品；但該方法的缺陷是標(biāo)準(zhǔn)品與待檢樣品處理方式不同，導(dǎo)致最終的檢測結(jié)果不能真實(shí)反映樣品中病毒的拷貝數(shù)。本研究利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，最大程度地降低試驗誤差，真實(shí)反映了所建立方法的敏感性[15]。本試驗將分子信標(biāo)應(yīng)用于流感病毒的檢測，憑借探針本身的高特異性和高靈敏度，建立了一種高效的H3N2豬流感的熒光定量PCR檢測方法。在定性檢測病毒的同時，還可以對病毒RNA 的含量進(jìn)行測定。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，操作方便快捷，可為豬流感H3N2亞型的檢測提供有效手段。對存檔的豬流感樣品的檢測結(jié)果和商品試劑盒的檢測結(jié)果符合率為100%，說明所建技術(shù)有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Establishment of a Molecular Beacon Real Time Fluorescent Quantitative PCR Assay for Detection of Swine Infl uenza Virus H3N2 Subtype

Yu Siyu1，Zhou Yu2，Tang Lianfei1，Meng Fang1，Yuan Xiaofen1，Liang Bin1
（1.Inspection Quarantine Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau，Changsha，Hunan 410004；2.Huizhou Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau，Huizhou，Guangdong 516006）

A new assay for the detection of swine influenza virus（SIV）was developed with a novel nucleic acid probe—molecular beacon. The specifi c primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of swine infl uenza virus（SIV）H3N2 subtype. A real-time fl uorescent quantitative PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. A series of dilutions of recombinant plasmids including pSK-H3 and pSK-N2 were prepared and used to generate standard curves. Under the optimized reaction conditions，the results showed that the developed assay was specifi c for detecting SIV with a detection limit of 102copies without cross-reactions to other swine viruses．The repeatability tests indicated that the inter-and intra-variation were less than 3%．The method was highly specifi c and sensitive，providing an effective method for detection of swine infl uenza virus H3N2 subtype．

swine infl uenza virus；H3N2 subtype；molecular beacon probe；real-time fl uorescent quantitative PCR

S 852.65+1

A

1005-944X（2015）07-0067-06

國家質(zhì)檢總局科技資助項目（2014IK243）

唐連飛