侯小強(qiáng)

（北京軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京東城 100700）

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）又稱血小板活化因子乙酰水解酶，是鈣離子非依賴性的磷脂酶（Larsson等，1999）。Lp-PLA2主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生和分泌（Hakkinen等，1999）。研究表明Lp-PLA2通過短的sn-2酯鍵作用于磷脂的水溶部分，產(chǎn)生兩種炎癥介質(zhì)：溶血卵磷脂（lyso-LPC）和氧化的非酯化脂肪酸（oxNE-FAS），均具有很強(qiáng)促炎癥反應(yīng)特征（Shi等，2007）。 此外，促炎因子 IL-6、TNF-α 也能促進(jìn)Lp-PLA2的表達(dá)，并且使其活性增加，形成促炎循環(huán)（Li等，2015）。炎癥在哺乳動物疾病發(fā)生發(fā)展和病毒傳播過程中扮演重要角色（Czarzasta和Jana，2013；Go·khan，2006）。研究豬Lp-PLA2與炎癥的關(guān)系將有助于利用動物模型豬研究炎癥性疾病。但目前豬的Lp-PLA2抗體制備研究鮮見報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建了豬Lp-PLA2原核表達(dá)載體，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化，最終獲得大量豬Lp-PLA2純化蛋白質(zhì)，使用該蛋白質(zhì)制備了多克隆抗體，并對該多克隆抗體的功能進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑 PET-28a質(zhì)粒、BL21菌種為本室保存。 NheI、XhoI、T4 DNA 連接酶 、Protein marker購 自 Fermentas 公 司 ；2×Taq Plus PCR MasterMix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、TRNzol-A+總RNA提取試劑、DNA MarkerⅢ和D15000均購自TIANGEN公司；Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒購自BIOER公司；Ni-NTA樹脂純化蛋白質(zhì)試劑盒購自Thermo公司；硝酸纖維素（NC）膜購自BOSTER公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自sigma公司。

1.2 目的基因的獲得和擴(kuò)增 使用TRNzol-A+提取豬單核細(xì)胞總RNA，用BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)得到cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因Lp-PLA2。PCR反應(yīng)總體系（25 μL）： 模板 1 μL （50 ng），2×Taq plus master mix 12.5 μL， 上游引物和下游引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min， 然后 94 ℃30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30 min，得到1317 bp目的條帶，進(jìn)行目的條帶回收，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將PET-28a質(zhì)粒載體和回收的目的片段用NheI和XhoI酶切之后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21菌種中，均勻涂在含LB固體培養(yǎng)基的平板上，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落，在液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒小量提取重組質(zhì)粒。用NheI和XhoI酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定得到片段5369 bp和1317 bp，并進(jìn)行DNA序列測定，確定質(zhì)粒構(gòu)建正確。

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 誘導(dǎo)表達(dá)：將菌種按1%接種到含Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞OD600為0.5～0.8（2～3 h）時，用一定濃度的IPTG在適當(dāng)溫度下誘導(dǎo)6～12 h，離心收集菌體，超聲破碎，分別取上清和沉淀做SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。如在上清中檢測到目的蛋白過表達(dá)，則為可溶性蛋白，反之則為包含體。

條件優(yōu)化：分別用 0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTG在不同溫度（16、20、28、37 ℃）下誘導(dǎo)菌體表達(dá)目的蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測上清和沉淀中目的蛋白的表達(dá)。確定其表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和溫度。

1.5 重組Lp-PLA2蛋白純化 大量誘導(dǎo)表達(dá)并收集菌體，超聲破碎，取沉淀得到含包含體的菌體蛋白，將沉淀溶于含8 mol/L尿素的Tris-Hcl緩沖液中進(jìn)行親和層析純化。Ni-NTA樹脂親和層析純化蛋白：5倍柱體積20%乙醇洗柱子，5倍柱體積水洗，10倍柱體積平衡液平衡；上樣；5倍柱體積洗滌液洗滌，不收集；20倍柱體積洗脫液洗脫，收集；10柱體積平衡液處理；5倍柱體積水洗柱子，5倍柱體積20%乙醇洗柱子，最后用20%乙醇將柱子浸泡，4℃保存。

1.6 抗血清的制備及檢測 將純化的Lp-PLA2蛋白作為抗原免疫家兔，免疫前各兔留取耳緣靜脈血2 mL，待分離血清作陰性對照。經(jīng)耳緣靜脈免疫家兔，每次注射抗原濃度均為800～1000 ng，首次加完全弗式佐劑注射混合乳化，以后加不完全弗式佐劑注射混合乳化，共注射4次，每次間隔14 d。每次注射前耳緣靜脈取血，分離血清進(jìn)行抗體檢測。末次注射后第7天，心臟取血，分離血清分裝并進(jìn)行抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 豬Lp-PLA2原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

根據(jù) NCBI中豬 Lp-PLA2序列（NM_001113013）設(shè)計(jì)引物，以豬血液單核細(xì)胞cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得條帶大小為1317bp的豬Lp-PLA2片段（圖1），連接到原核表達(dá)載體PET-28a中，并進(jìn)行酶切鑒定和測序驗(yàn)證（圖2）。結(jié)果顯示，成功獲得了豬Lp-PLA2原核表達(dá)載體。

圖1 豬Lp-PLA2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 豬Lp-PLA2原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 豬Lp-PLA2的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化和鑒定將Lp-PLA2轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21細(xì)胞中，在不同溫度（16、20、28、37 ℃） 下，用不同濃度的 IPTG（0.5、0.75、1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并分別對菌體和上清進(jìn)行SDS-PAGE，檢測目的蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在37℃、1 mol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，菌體中Lp-PLA2以包含體形式表達(dá)量最高（圖3和圖4）。

2.3 豬Lp-PLA2的表達(dá)與純化 對豬Lp-PLA2進(jìn)行大量誘導(dǎo)，條件為37℃、IPTG 1 mmol/L。將獲得的菌體超聲破碎，然后用 Ni-NTA樹脂進(jìn)行親和層析純化，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定（圖5）。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)成功獲得豬Lp-PLA2蛋白。

圖3 不同濃度IPTG誘導(dǎo)Lp-PLA2表達(dá)

圖4 不同溫度IPTG誘導(dǎo)Lp-PLA2表達(dá)

圖5 豬Lp-PLA2蛋白純化結(jié)果

2.4 Lp-PLA2多克隆抗體制備和檢測 將純化的豬Lp-PLA2蛋白質(zhì)作為抗原，免疫兔子，在一定時間內(nèi)對血清進(jìn)行免疫檢測。分別以誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白和豬單核細(xì)胞總蛋白為抗原檢測抗體（圖6和圖7）。結(jié)果顯示，獲得的豬Lp-PLA2抗體既能夠與自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也能檢測豬體組織中Lp-PLA2的表達(dá)。

圖6 菌體蛋白驗(yàn)證豬Lp-PLA2多克隆抗體

圖7 豬Lp-PLA2多克隆抗體的檢測

3 討論

Lp-PLA2是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥相關(guān)因子，研究Lp-PLA2的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。因此，本研究制備的豬Lp-PLA2抗體有助于研究豬體內(nèi)Lp-PLA2與炎癥的關(guān)系，并為利用豬作為動物模型研究疾病防控提供理論依據(jù)。

[1]Czarzasta J，Jana B.Inflammation changes the expression of leukotriene receptors in porcine uteri[J].J Reprod Immunol，2013，100（2）：93～103.

[3]Hakkinen T，Luoma J S，Hitumen M O，et al.Lipoprotein-associated phospholipase A （2），platelet-activating factor acetylhydrolase，is expressed by macrophagesin human and rabbitatherosclerotic lesions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19（12）：2909～17.

[4]Larsson F P，Kennedy B P，Claesson H E.The human calcium-independent phospholipase A2 gene multiple enzymes with distinct properties from a single gene[J].Eur J Biochem，1999.262（2）：575～85.

[5]Li Z，Ren W，Han X，et al.ω3-polyunsaturated fatty acids suppress lipoprotein-associated phospholipase A2 expression in macrophages and animal models[J].Mol Nutr Food Res，2015.doi：10.1002/mnfr.201500022.

[6]Shi Y，Zhang P，Zhang L F，et al.Role of lipoprotein-associated phospholipase A2 in leukocyte activation and inflammatory responses[J].Atherosclerosis，2007，191（1）：54～62.