蘇 欣

（白城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林白城 137000）

骨骼肌分化是一個復(fù)雜并且嚴(yán)格的程序化過程，由中胚層細(xì)胞定向分化成成肌細(xì)胞，然后成肌細(xì)胞增殖，不可逆地退出細(xì)胞周期，最終由單核前體細(xì)胞融合形成多核體細(xì)胞 （肌管）（Sabourin和Rudnicki，2000）。在這個復(fù)雜的過程中，肌肉調(diào)節(jié)因子（MRFs）起到重要的調(diào)節(jié)作用。MRFs屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋 （bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族，包括Myf5、MyoD、Myf6 和 myogenin （Yun 和 Wold，1996），其中myogenin在骨骼肌分化的后期起到重要的調(diào)節(jié)作用（Pownall等，2002）。 Myogenin基因敲除小鼠出生后由于骨骼肌發(fā)育嚴(yán)重缺陷致死，其肌細(xì)胞不能融合形成多核的肌纖維（Hasty等，1993）。有報道稱下調(diào)內(nèi)源myogenin基因的表達(dá)可以抑制C2C12成肌細(xì)胞的分化（Mastroyiannopoulos等，2012）。

miRNAs是一類高度保守的，長約22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可結(jié)合于靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)，促進(jìn)其mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄（Bartel，2009）。 大量研究指出，miRNAs可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成過程中相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如miR-148可通過抑制ROCK1基因而促進(jìn)肌肉分化 （Zhang等，2011），miR-27可通過調(diào)節(jié)PAX3而影響成肌進(jìn)程（Crist等，2009）。本試驗旨在研究miR-186對C2C12成肌細(xì)胞中myogenin基因的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 鼠源成肌細(xì)胞C2C12，購自中國科學(xué)院上海生化所干細(xì)胞庫。

主要試劑：DMEM（Hyclone）、胎牛血清（FBS，Gibco）、馬血清（Gibco）、谷氨酰胺（Invitrogen）、細(xì)胞裂解液（Promega）、TRNzol-A+reagent（天根，北京）、熒光素酶報告分析系統(tǒng) （Promega）、抗體myogenin（abcam）、GAPDH（武漢三鷹）、山羊抗兔和山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的二抗（碧云天）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：將C2C12細(xì)胞等密度接種于6孔板，用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)（GM，含10%濃度的胎牛血清），培養(yǎng)細(xì)胞長至70% ～80%密度時，換成分化培養(yǎng)基（DM，含2%濃度的馬血清）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 d，誘導(dǎo)其分化。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將100 pmol的miRNA mimic、antimiR和陰性對照miRNA與X-tremeGENE 9轉(zhuǎn)染試劑（Roche）加入到Opti-MEM培養(yǎng)液中（Invitrogen）。24 h后，將構(gòu)建的小鼠野生型 myo genin 3'-UTR熒光素酶質(zhì)粒和對照質(zhì)粒用脂質(zhì)體3000（Invitrogen）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA 使用miR-cute miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）對收獲的細(xì)胞進(jìn)行RNA提取。然后用cDNA第一鏈合成試劑盒（天根，北京）制備合成cDNA。

1.4 實時熒光定量PCR （qRT-PCR） 使用BioEasy SYBR Green I實時 PCR試劑盒（Bioer Technology，杭州）對上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件如下：

95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。使用BIORAD iQ5 Multicolor Real-Time PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，每個樣本重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)印跡 取出細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗2次，每孔加入200 μL的細(xì)胞裂解液，在冰面上裂解10 min后吸取至離心管，冰上繼續(xù)裂解 10 min，4℃、12000 r/min離心 10 min，吸取上清。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，恒壓80 V電泳約2 h。然后在90 V的條件下電轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗 （myogenin稀釋濃度為1∶2000；GAPDH的稀釋濃度為 1∶4000）4℃孵育過夜。TBST洗滌NC膜3次，每次室溫?fù)u動洗滌10 min。加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠或羊抗兔IgG抗體（稀釋濃度均為1∶2000），室溫?fù)u動 1 h，再用 TBST洗滌NC膜3次，每次室溫?fù)u動洗滌10 min。ECL化學(xué)發(fā)光后分析結(jié)果。

1.6 熒光素酶活性分析 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收獲并裂解細(xì)胞，使用熒光素酶活性分析試劑盒分析熒光素酶活性，經(jīng)酶標(biāo)儀定量后與標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶表達(dá)對照進(jìn)行對比分析得到結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 C2C12細(xì)胞分化過程中miR-186的變化將C2C12細(xì)胞用生長培養(yǎng)基（GM）培養(yǎng)，培養(yǎng)至80% ～90%密度后，換成分化培養(yǎng)基（DM）培養(yǎng)，在1～4 d時分別收取細(xì)胞并對其中miR-186的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，miR-186在剛剛換至分化培養(yǎng)基的第1天時表達(dá)顯著增加（P＜0.05），并隨著分化完成（第2～4天）表達(dá)量逐漸下降（P＜0.01或 P ＜ 0.05）（圖 1）。

圖1 miR-186在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-186抑制C2C12細(xì)胞分化過程中myogein基因的表達(dá) 為了研究miR-186是否可調(diào)節(jié)內(nèi)源myogenin水平，將miR-186 minics和miR-186抑制劑（amiR-186）分別轉(zhuǎn)染入經(jīng)分化培養(yǎng)基（DM）誘導(dǎo)分化1 d的C2C12細(xì)胞中，通過Western Blot檢測到C2C12細(xì)胞中內(nèi)源myogenin的蛋白水平，與陰性對照miRNA相比，miR-186可以明顯抑制分化中的C2C12細(xì)胞的myogenin水平，而amiR-186則反之（圖2）。

圖2 miR-186對誘導(dǎo)分化的C2C12中myogenin蛋白的調(diào)節(jié)

2.3 miR-186通過與myogenin的3'-UTR區(qū)結(jié)合抑制myogenin 為了檢測miR-186是否作用于myogenin的3'-UTR，將小鼠myogenin的3'-UTR區(qū)插入到熒光素酶基因下游后轉(zhuǎn)入293t細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與單獨轉(zhuǎn)入myogenin的3'-UTR區(qū)，或者同時轉(zhuǎn)入myogenin 3'-UTR區(qū)和miRNA陰性對照（miR對照）相比，轉(zhuǎn)入miR-186可以有效地抑制約60%的熒光素酶活性 （P＜0.05）（圖3）。說明miR-186通過作用于myogenin的3'-UTR區(qū)來抑制myogenin。

3 討論與結(jié)論

圖3 熒光素酶分析檢測miR-186對myogenin的3'-UTR的作用

miR-186在C2C12細(xì)胞分化前期顯著上調(diào)，隨著分化的逐漸完成，miR-186的表達(dá)量也隨之下降，這說明miR-186對C2C12細(xì)胞分化存在著某種調(diào)控作用。同時，本試驗證明miR-186結(jié)合于myogenin的3'-UTR區(qū)從而抑制其表達(dá)。由此可見，miR-186可能通過抑制myogenin基因的表達(dá)而抑制C2C12成肌細(xì)胞的分化過程。

盡管miR-186在骨骼肌和心肌中表達(dá)影響肌肉分化，但是miR-186并不是肌肉特異性表達(dá)的，也有文獻(xiàn)指出miR-186在癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào) 節(jié) 中 起 作 用 （Cai等 ，2013；Zhou 等 ，2008）。miR-186存在于ZRANB2基因的第8和第9外顯子之間的內(nèi)含子中，其表達(dá)與ZRANB2基因的表達(dá)呈正相關(guān)性，而ZRANB2廣泛表達(dá)于多種組織中（Adams等，2001）。

本試驗結(jié)果表明，miR-186在C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化初期表達(dá)上調(diào)，并且是myogenin的調(diào)節(jié)子，能通過作用于myogenin的3'-UTR區(qū)抑制myogenin的表達(dá)，從而抑制肌細(xì)胞的分化。

[1]Adams D J，van der Weyden L，Mayeda A，et al.ZNF265-a novel spliceosomal protein able to induce alternative splicing[J].The Journal of cell biology，2001，154：25～32.

[2]Bartel D P.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions[J].Cell，2009，136：215～233.

[3]Cai J，Wu J，Zhang H，et al.miR-186 downregulation correlates with poor survival in lung adenocarcinoma，where it interferes with cell-cycle regulation[J].Cancer research，2013，73：756～766.

[4]Crist C G，Montarras D，Pallafacchina G，et al.Muscle stem cell behavior is modified by microRNA-27 regulation of Pax3 expression[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106：13383～13387.

[5]Hasty P，Bradley A，Morris J H，et al.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene[J].Nature，1993，364：501～506.

[6]Mastroyiannopoulos N P，Nicolaou P，Anayasa M，et al.Down-regulation of myogenin can reverse terminal muscle cell differentiation[J].PloS one，2012，7：e29896.

[7]Pownall M E，Gustafsson M K，Emerson Jr C P.Myogenic regulatory factors and the specification of muscle progenitors in vertebrate embryos[J].Annual review of cell and developmental biology，2002，18：747～783.

[8]Sabourin L A，Rudnicki M A.The molecular regulation of myogenesis[J].Clinical genetics，2000，57：16～25.

[9]Yun K，Wold B.Skeletal muscle determination and differentiation：story of a core regulatory network and its context[J].Current opinion in cell biology，1996，8：877～889.

[10]Zhang H，Li Y，Huang Q，et al.MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer[J].Cell death and differentiation，2011，18：1702 ～1710.

[11]Zhou L，Qi X，Potashkin J A，et al.MicroRNAs miR-186 and miR-150 down-regulate expression of the pro-apoptotic purinergic P2X7 receptor by activation of instability sites at the 3'-untranslated region of the gene that decrease steady-state levels of the transcript[J].The Journal of biological chemistry，2008，283：28274～28286.