趙建國，李琴，陶大利，姜金斗

（農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心哈爾濱，150090）

0 引言

砷是一種廣泛分布于自然界的元素。各種不同的砷形態(tài)其物理、化學(xué)性質(zhì)、毒性亦各不相同。其中無機砷的毒性最大如As（Ⅲ）和As（Ⅴ）,有機砷的毒性較小如MMA和DMA,而AsB,AsC和砷糖等通常被認(rèn)為是無毒的[1]。因此,分析砷在食品的形態(tài)對評價對人體危害的風(fēng)險分析具有重要意義。國家對液態(tài)乳總砷限量要求為0.1 mg/kg；乳粉為0.5 mg/kg[2]。

砷不同形態(tài)分析研究近年來報道較多，主要集中在水產(chǎn)品及環(huán)境樣品等[3-14,20-23]，而其他食品[15-16]特別是生乳及乳制品中不同砷形態(tài)含量的分析研究方面少有報道[1]。由于通用的原子熒光僅能對樣品中的無機砷或經(jīng)消化處理后的總砷進行測定[17]。其他測定不同砷形態(tài)方法如微波萃取-原子熒光光譜法、離子色譜法也有報道[18-19]，但目前對測定不同砷形態(tài)仍以HPLC-ICP-MS方法最多。乳品類樣品基質(zhì)復(fù)雜，本研究重點集中在樣品前處理優(yōu)化方面：通過酶水解解決了對不同砷形態(tài)的吸附問題，通過采用萃取小柱以脫去脂肪。從而實現(xiàn)了對乳品中5種不同砷形態(tài)的準(zhǔn)確測定。

1 實驗

1.1 試劑

無水乙酸鈉，硝酸鉀，磷酸二氫鈉，氫氧化鈉，無水乙酸鈉，無水乙醇，檸檬酸鈉，冰乙酸，乙二胺四乙酸二鈉，堿性蛋白酶（20萬單位），砷甜菜堿、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 儀器及材料

Waters 2695高效液相色譜，ICP-MS Elan6000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；固相萃取裝置；PEP-2SPE小柱，200mg/6mL；高速冷凍離心機。

1.3 樣品處理

1.3.1 酶解析提取砷

稱取生乳樣品40 g（精確至0.1 mg）或乳粉樣品稱取8g（精確到0.1 mg）于錐形瓶中，乳粉用30 mL溫水溶解樣品。用濃度為0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH=9.5后分別加入0.2 g堿性蛋白酶（20萬活力單位），放入60℃恒溫箱中水解30 min。取出后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%檸檬酸溶液4.0 mL，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。4℃冰箱中靜止5 min，將部分樣液轉(zhuǎn)入離心管中，以8 000 r/min離心10 min，同時做試劑空白實驗。

1.3.2 固相萃取柱脫脂凈化

將PEP-2SPE小柱置于固相萃取裝置上，用5mL甲醇活化，用5mL去離子水過柱并排干，吸取2mL樣液過柱棄掉后，再吸取3mL樣液通過小柱,并接收于試管中，通過0.45 μm濾膜過濾后用于測定。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：陰離子保護柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm,11 μm）；陰 離子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4mm,7.5 μm）；柱溫 35 ℃ ；流速 1.0mL/min；進樣量50μL；流動相[10 mmol/L無水乙酸鈉+3mmol/L硝酸鉀+2.0 mmol/L磷酸二氫鈉+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，用4.0%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=10.7]∶無水乙醇為99∶1。

1.4.2 ICP-MS條件

積分時間1 s；功率1 100 W；玻璃同心霧化器；載氣流量1.0L/min；輔助氣流量1.2 L/min；采集質(zhì)量數(shù)74.9216；靈敏度≥260 mg/L；進樣管內(nèi)徑≤0.2 mm。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別用超純水將5種形態(tài)砷質(zhì)量濃度分別為10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為 0.0，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在優(yōu)化的實驗條件下,測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,等離子體色譜軟件計算各色譜峰的積分面積并自動繪制校準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理的優(yōu)化

2.1.1 蛋白質(zhì)等吸附對不同砷形態(tài)測定結(jié)果的影響

由于生乳及乳粉中成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)及脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，基質(zhì)干擾大。為能達(dá)到既能有效降低基質(zhì)干擾，又能準(zhǔn)確測定各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目的，前處理技術(shù)尤為重要。由于乳蛋白具有較強的吸附性，對不同砷形態(tài)可能具有明顯的吸附作用，若不能從中解析出來就會造成測定結(jié)果偏低，達(dá)不到準(zhǔn)確測定的目的。為此通過加入堿性蛋白酶的方式將蛋白質(zhì)進行降解后測定收到顯著的效果。

由于樣品中各組分質(zhì)量濃度甚微，為此采用加入標(biāo)準(zhǔn)樣品的方式以考察蛋白對待測物因吸附而造成的影響。其實驗方法為將生乳在高壓滅菌鍋中滅菌后取出，冷至室溫后在超凈工作臺中分別稱取40 g樣品置于150 mL錐形瓶中，分四組，每組4個樣品。每組中3個樣品分別加入各含有0.250 μg砷不同形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，1個樣品作為空白。先取其中兩組其中一組加入堿性蛋白酶、一組不加入堿性蛋白酶直接按1.3樣品處理方法進行處理后測定其質(zhì)量濃度；另兩組密閉后在無菌狀態(tài)室溫下放置2周，按上法進行處理后分別測定其質(zhì)量濃度，以考察各組分變化情況。通過測定，所有未加入標(biāo)準(zhǔn)品的樣品各組分均未檢出，在表1中就不再一一列出，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，加入標(biāo)準(zhǔn)砷樣品后直接測定兩組處理，不同砷形態(tài)回收率測定結(jié)果加酶處理稍高于未酶處理，但無變化顯著差異。而加入標(biāo)準(zhǔn)砷樣品放置兩周后再測定則差異顯著，特別是AsⅢ未加酶回收率僅81.2%，加酶處理達(dá)99.2%，說明乳蛋白對不同砷形態(tài)各組分都有一定的吸附。采用堿性蛋白酶將乳蛋白降解后可有效釋放出被吸附的砷。

表1 堿性蛋白酶處理前后不同砷形態(tài)測定結(jié)果（n=3）

2.1.1 PEP固相萃取小柱處理后對測定結(jié)果的影響

由于生乳及乳粉中含有較高的脂肪，根據(jù)該色譜柱的特性，若大量的脂肪進入陰離子分析柱，將會使脂肪吸附于色譜柱內(nèi)很難被洗脫，從而即影響色譜柱的分離，同時又可使色譜柱壽命大大縮短。另外若脂肪被導(dǎo)入等離子焰炬中會造成錐管等處積碳，從而使靈敏度降低，基質(zhì)干擾增大，為此必需先將樣品中脂肪去除。脂肪去除方式可采用有機溶劑如正己烷等去除，也可采用固相萃取小柱。本研究采用固相萃取小柱去除脂肪效果較好，且操作簡便，同時避免了因大量使用有機溶劑而對人體產(chǎn)生的危害。

2.2 方法線性范圍與檢出限

按照1.4分析方法,分別對5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，在系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見圖1和表1）。采用生乳樣品按照1.3樣品處理方法處理后對各組分進行了最低檢出限的測定，并以本底3倍噪音分別計算樣品最低檢出限，結(jié)果如表2。

圖1 5種不同砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2可知，5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，相關(guān)系數(shù)（r）在0.9996～0.9999間；最低檢出限在0.5～1.6 μg/kg間。完全可以滿足國家限量標(biāo)準(zhǔn)乳中總砷為0.1 mg/kg規(guī)定測定的要求。

2.3 方法的回收率和精密度

分別選取嬰兒配方奶粉與生乳添加五種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液后按1.3進行樣品處理，測定回收率；分別稱取6份嬰兒配方奶粉與生乳樣品后再分別添加0.250 μg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，處理液分別進樣測定精密度，未添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的兩樣品測定值均為小于檢出限。經(jīng)測定，兩樣品各組分不同添加量回收率平均值A(chǔ)sB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%，兩個樣品RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。回收率與精密度測定結(jié)果如表3和表4所示。

表2 5種形態(tài)砷分線性回歸方程與最低檢出限

3 樣品分析

選取乳粉、生鮮奶各3種,按所建立的HPLC-ICP-MS的分析方法檢測5種形態(tài)砷含量,以驗證實際應(yīng)用的可靠性。結(jié)果參見表5。圖2為奶粉樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種形態(tài)砷的色譜圖。結(jié)果表明,所檢測樣品中只檢測出了AsⅢ和AsV，其含量極低，遠(yuǎn)低于國家限量標(biāo)準(zhǔn),故樣品中無機砷的指標(biāo)是安全的。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及奶粉樣品提取液色譜

4 結(jié)論

（1）本研究建立了生乳與乳制品中5中形態(tài)砷的液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜測定方法。該法具有樣品處理簡單、測定周期短、靈敏度高等優(yōu)點。

（2）通過對樣品前處理方法的優(yōu)化。通過在樣品中加入砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，放置2周后采用堿性蛋白酶水解前后的比較，發(fā)現(xiàn)水解乳蛋白后可將吸附態(tài)的砷解析。酶水解液再加入3%檸檬酸可進一步去除雜質(zhì)，從而大大減小了基質(zhì)干擾。樣液再通過PEP固相萃取小柱處理則可有效去除樣液中的脂肪，使色譜柱的分離度顯著提高、色譜柱的壽命延長。通過上述對樣品的處理，從而實現(xiàn)了準(zhǔn)確測定乳品中5種形態(tài)砷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，大大提高了檢測靈敏度；AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV 最低檢出限分別達(dá)到 0.56，0.54，1.56，1.56，0.84 μg/kg，滿足了對痕量成分測定的要求。

（3）該方法砷質(zhì)量濃度在0～10 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。5種形態(tài)砷其相關(guān)系數(shù)（r）全部在0.999以上。

（4）AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV的加標(biāo)回收率平均值分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%；RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。完全能滿足微量成分定量測定的要求。

表3 樣品中5種形態(tài)砷回收率測定結(jié)果

表4 樣品5種形態(tài)砷精密度測定結(jié)果

表5 生乳與乳粉中5種形態(tài)砷測定結(jié)果（n=3） μg·kg-1

（5）通過對生乳及乳粉樣品的測定，只檢出了AsⅢ和AsV，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)[2]要求。

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