周晶，周穎，曹鳳波，劉賓，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

大腸桿菌典型菌株O157：H7能夠引起溶血性尿毒癥、腹瀉及出血性腸炎等疾病，危害人類健康[1]。腸道粘膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御的重要防線，它能阻止病原微生物與腸上皮細(xì)胞的接觸并通過(guò)抗原的刺激激發(fā)機(jī)體相應(yīng)的免疫應(yīng)答。病原菌入侵機(jī)體后，非特異性免疫系統(tǒng)被激活，病原菌被吞噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，溶酶體將病原菌降解，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞等具有免疫功能的細(xì)胞，促使這些細(xì)胞分泌IL-2等細(xì)胞因子。細(xì)胞因子能夠參與機(jī)體免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫和固有免疫應(yīng)答。sIgA是機(jī)體腸黏膜免疫系統(tǒng)重要的抗體之一，由sIgA參與的體液免疫是防御病原菌在腸黏膜定植的重要防線[2]。sIgA和細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度是研究腸道粘膜免疫反應(yīng)的重要參考指標(biāo)[3]。

乳酸桿菌能刺激腸粘膜免疫系統(tǒng)分泌sIgA等抗體及IL-6等細(xì)胞因子，對(duì)于大腸桿菌引起的腹瀉起到預(yù)防和治療的作用[4]。副干酪乳桿菌LAFTI L26能夠促進(jìn)IL-2等細(xì)胞因子的分泌，提高機(jī)體的免疫力[5]。本研究以副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986為目標(biāo)益生菌，探究其對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

菌種：副干酪乳桿菌KLDS1.0351，植物乳桿菌KLDS1.0985和 KLDS1.0986。大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7 ATCC 43889）。

實(shí)驗(yàn)用小鼠：小鼠購(gòu)買自哈獸研六周齡，等級(jí)為清潔級(jí)，體重約在20～25 g的雌性BALB/c小鼠；

試劑盒：小鼠sIgA，白細(xì)胞介素（IL-2、IL-6），IFN-γ ELISA試劑盒。

設(shè)備：高壓滅菌鍋HVE-50HIRAYAM，恒溫培養(yǎng)箱，Model680型酶標(biāo)儀，VD-1320潔凈工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液的制備

將穩(wěn)定期的副干酪乳桿菌、植物乳桿菌及大腸桿菌菌液6 000 rpm離心10 min，收集菌體無(wú)菌PBS洗滌兩次，棄去上清液，用PBS懸浮并調(diào)節(jié)菌濃度至108cfu/mL，4 ℃保存?zhèn)溆肹6-7]。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組

試驗(yàn)將小鼠分為四組（空白組；大腸桿菌對(duì)照組；副干酪乳桿菌組；植物乳桿菌組），每天12∶00進(jìn)行灌胃，灌胃體積為0.2 mL[8]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如表1所示。分別在第1，3，5，7，9，11，13，15 d 9∶00（提前進(jìn)食）處死4組小鼠，每組3只，解剖取小腸組織。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 小鼠外觀及生長(zhǎng)狀況觀察

試驗(yàn)期間觀察小鼠的進(jìn)食、毛色、精神狀態(tài)、體重及糞便變化。

1.2.4 sIgA的測(cè)定

縱向剖開(kāi)小腸，5 mL無(wú)菌的PBS沖洗小腸內(nèi)容物，在4℃、10 000×g條件下離心10 min,收集上清液分裝于離心管中，在-20℃下儲(chǔ)存，待樣品收集完后用sIgA ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定[9-10]。

1.2.5 細(xì)胞因子的測(cè)定

將小腸稱重后按PBS∶小腸=9∶1的比例加入無(wú)菌PBS，用組織勻漿器將小腸破碎后倒入離心管中，在4℃（8 000 r/min）條件下離心10 min收集上清液并分裝于離心管中，-20℃下儲(chǔ)存，待樣品收集完后用細(xì)胞因子ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定[11-12]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel進(jìn)行相關(guān)性及方差分析并繪制圖標(biāo)，以0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 灌胃期間小鼠外觀及體質(zhì)量的變化

在灌胃期間觀察小鼠的外觀及體重變化。當(dāng)小鼠的食欲降低、出現(xiàn)腹瀉及毛色變得不柔順沒(méi)有光澤甚至出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象時(shí)說(shuō)明小鼠感染大腸桿菌模型建立成功。試驗(yàn)第4 d小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，精神萎靡，進(jìn)食量減少，出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，說(shuō)明大腸桿菌感染模型建立成功。從第8d補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后，小鼠的精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，進(jìn)食量增加，腹瀉癥狀逐漸緩解。灌胃期間小鼠體質(zhì)量的變化如圖1所示。

圖1 兩株乳酸桿菌對(duì)感染大腸桿菌O157：H7小鼠體質(zhì)量的影響

由圖1可以看出，在1～14 d的灌胃中空白組小鼠的體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，在1～7 d灌胃大腸桿菌的小鼠體質(zhì)量呈下降的趨勢(shì)，從第3天開(kāi)始，灌胃大腸桿菌的三組小鼠體質(zhì)量與空白組差異顯著（P＜0.05）。第8天對(duì)小鼠補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，從第9 d開(kāi)始小鼠的體質(zhì)量有所上升，雖然體重仍低于空白組和致病前的初始體質(zhì)量，但與未補(bǔ)充大腸桿菌的對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。在灌胃兩株乳酸桿菌后，小鼠的體質(zhì)量有所增加，而對(duì)照組的小鼠體質(zhì)量仍繼續(xù)下降,這說(shuō)明該兩株乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體質(zhì)量減輕的癥狀能夠起到一定的緩解作用；當(dāng)在灌胃后的第15天對(duì)小鼠進(jìn)行稱量發(fā)現(xiàn)兩株乳酸菌組小鼠的體質(zhì)量之間并沒(méi)有顯著性差異，這說(shuō)明兩株乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體質(zhì)量減輕的緩解作用水平是相當(dāng)?shù)摹?/p>

2.2 兩株菌株對(duì)感染小鼠腸黏膜免疫的影響

2.2.1 對(duì)小鼠腸黏膜sIgA的影響

sIgA對(duì)致病菌在腸道的定植起到抑制作用，能與微生物等抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物[13-14],對(duì)維持機(jī)體腸道健康有著重要意義。小鼠在1～14 d灌胃中sIgA的變化如圖2所示。

圖2 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜sIgA質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，空白組小鼠sIgA的質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定；小鼠在感染大腸桿菌后sIgA的分泌量開(kāi)始增加，并在第5 d達(dá)到最大值，從第7 d開(kāi)始sIgA的分泌量減少，第11 d sIgA的質(zhì)量濃度低于空白組，從第13 d開(kāi)始與空白組差異顯著（P＜0.05）；第8 d開(kāi)始對(duì)小鼠分別補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌，從第9 d開(kāi)始兩株乳酸菌組sIgA的質(zhì)量濃度上升，并且與空白組及對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），當(dāng)在第11 d達(dá)到最大值。兩株乳酸菌引起腸粘膜中sIgA的質(zhì)量濃度增加遠(yuǎn)高于大腸桿菌引起sIgA增加的最高水平。

2.2.2 對(duì)小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

IFN-γ能夠抑制IgE的分泌進(jìn)而抑制由IgE引起的I型超敏反應(yīng)[15],IFN-γ還可以激活NK細(xì)胞，是機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子。小鼠在1～14 d灌胃中IFN-γ的變化如圖3所示。

圖3 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

由圖3可以看出，空白組小鼠IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)穩(wěn)定，小鼠感染大腸桿菌后IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在第3 d達(dá)到最大值，之后降低，從第7 d開(kāi)始低于對(duì)照組，在第15 d與空白組差異顯著（P＜0.05）；在第8 d補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后，IFN-γ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，與空白組和對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。其中副干酪乳桿菌在第11 d達(dá)到最大值，之后下降，植物乳桿菌在第9 d達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降。兩株乳酸桿菌引起的IFN-γ的增加遠(yuǎn)高于小鼠感染大腸桿菌引起的IFN-γ增加的最大值。

2.2.3 對(duì)小鼠腸黏膜IL-2的影響

IL-2是由T細(xì)胞合成的，能夠降低炎癥作用，對(duì)由感染致病菌引起的免疫抑制起到一定的緩解作用[16]。小鼠在1～14 d灌胃中IL-2的變化如圖4所示。

圖4 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IL-2的影響

由圖4可以看出，空白組小鼠IL-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較為穩(wěn)定；對(duì)照組小鼠在灌胃大腸桿菌后IL-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在第3天達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降，第9天與空白組差異顯著（P＜0.05）；第8天補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后，IL-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第9天開(kāi)始增加，副干酪乳桿菌在第11天達(dá)到最大值，植物乳桿菌在第13天達(dá)到最大值；兩株乳酸桿菌組IL-2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于空白組和對(duì)照組（P＜0.05），在第15天時(shí)仍然與對(duì)照組和空白組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.4 對(duì)小鼠腸粘膜IL-6的影響

IL-6能夠參與NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞活化，還能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。小鼠在1～14 d灌胃中IL-6的變化如圖5所示。

圖5 兩株乳酸桿菌對(duì)小鼠腸黏膜IL-6的影響

由圖5右以看出，空白組IL-6質(zhì)量分?jǐn)?shù)較為穩(wěn)定；灌胃大腸桿菌后，IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加并在第5天達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降,從第9天開(kāi)始小于對(duì)照組；在第8天對(duì)小鼠補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，IL-6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，并與對(duì)照組及空白組差異顯著（P＜0.05）；植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別在第9天和第11天達(dá)到最大值，之后雖然有所下降，但均與對(duì)照組及空白組差異顯著（P＜0.05），且高于大腸桿菌引起的最大值。

2.3 討論

對(duì)感染大腸桿菌的小鼠分別補(bǔ)充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，小鼠的體質(zhì)量有所上升，但仍較空白組低，說(shuō)明乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌引起的小鼠體重減輕有一定的延時(shí)性，如果長(zhǎng)期服用效果可能會(huì)更好。小鼠在感染大腸桿菌初期sIgA及細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度上升，之后下降，這可能是由于大腸桿菌入侵后會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但隨著大腸桿菌的不斷入侵，小鼠腸黏膜免疫遭到破壞，抑制了細(xì)胞因子的分泌。補(bǔ)充兩株乳酸桿菌后，sIgA及三種細(xì)胞因子的分泌量顯著提高且都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌引起的最大分泌量，由此我們猜測(cè)細(xì)胞因子及sIgA的分泌量是導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)照組與兩株乳酸桿菌組小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)差異的主要原因，乳酸桿菌可以調(diào)節(jié)腸粘膜中的細(xì)胞因子及sIgA的質(zhì)量濃度進(jìn)而對(duì)免疫機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)機(jī)體感染大腸桿菌起到治療的作用，這與相關(guān)研究也是吻合的[17]。

3 結(jié)論

副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986能對(duì)大腸桿菌感染引起的腹瀉和體重減輕起到緩解的作用，兩株菌株能顯著促進(jìn)感染大腸桿菌小鼠腸粘膜中IFN-γ，IL-2，IL-6及腸道中sIgA的分泌，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌刺激的最大值。

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