王茜，王昕，張杰，李倬林，李鐵柱

（1.吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，長春130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長春130124）

0 引言

干酪是我國乳制品工業(yè)新的增長點，凝乳酶是干酪產(chǎn)業(yè)的核心原料，其品質決定了干酪的品質。世界干酪生產(chǎn)中所使用凝乳酶約30%為微生物來源的基因工程凝乳酶[1-2]。

我國干酪生產(chǎn)所使用的高品質凝乳酶基本依賴進口，國產(chǎn)凝乳酶主要從小牛皺胃中獲得，來源不穩(wěn)定且成本較高。開發(fā)成本低、生產(chǎn)周期短的基因工程凝乳酶對于我國干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3-5]。然而，微生物來源的基因工程凝乳酶普遍具有水解專一性差和熱穩(wěn)定性過高的缺陷[6-8]。

本研究針對前期構建的微小毛霉凝乳酶表達載體[9,10]，依托計算機輔助分子模擬技術確定了突變位點Thr218（第218位蘇氨酸）和Leu287（第287位亮氨酸）[11]，通過生物工程技術實施分子改造，旨在獲得更適于干酪加工的基因工程凝乳酶。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

巴斯德畢赤酵母GS115，大腸桿菌DH5α，重組微小毛霉凝乳酶質粒由本實驗室前期構建。

LLB培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂粉1.5%）；YPD酵母培養(yǎng)基（酵母浸提物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%）。均為質量分數(shù)，下同。

1.1.2 試劑和儀器

PrimeSTAR HS DNA Polymerase，限制性內切酶，DNA marker，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶基因定點突變引物設計

微小毛霉凝乳酶基因定點突變方法采用PCR介導的一步法突變技術。根據(jù)PCR介導的一步法定點突變引物設計原則，利用primer5.0引物設計軟件，設計 Thr218Ser（T218S）、Thr218Ala（T218A）、Leu287Gln（L287G）三對含預定突變的完全互補的寡核苷酸引物，送生工生物上海股份有限公司合成,如表1所示。

表1 定點突變所用引物

1.2.2 凝乳酶基因定點突變PCR反應

以實驗室前期構建的重組微小毛霉凝乳酶質粒為模板，及PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真聚合酶，分別用3對引物對目的基因進行定點突變。PCR反應中各物質及含量如表2所示。

表2 PCR反應體系

表2中，PCR擴增條件為94℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，68 ℃退伙延伸5 min；18次循環(huán)；72 ℃后延伸8 min。

本研究通過預實驗來確定PCR反應中的模板DNA的質量濃度，以保證在PCR成功擴增的同時，模板質粒能被DpnI酶完全消化，提高突變效率。選擇的模板質量濃度分別為20，30，40和50 μg/mL。PCR結束后取10 μL上樣進行質量分數(shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 突變結果驗證

采用寶生物公司的mix酶及微小毛霉凝乳酶基因通用引物α-Factor（TACTATTGCCAGCATTGCTGC）3`AOX1（GCAAATGGCATTCTGACATCC）進行突變質粒的擴增，質粒經(jīng)EcoRI和NotI酶切后DNA電泳，完成PCR擴增目的基因和雙酶切初步驗證。

PCR擴增條件：94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；共進行31個循環(huán)；72℃后延伸10 min。雙酶切及PCR鑒定結果正確的質粒，送生工生物上海股份有限公司進行序列測定。

1.2.4 重組子的篩選

質粒DNA的線性化有利于提高轉化效率和與酵母基因組DNA組整合效率。SacI酶切后可與酵母基因組DNA發(fā)生單交換可提高轉化拷貝數(shù)。設定質粒濃度梯度，來確保質粒DNA完全線性化。之后采用乙醇沉淀法將線性化的質粒濃縮后電轉入畢赤酵母中，分別挑取平板上30個單克隆轉化子，轉接入15 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，培養(yǎng)30 h后，每隔24 h向培養(yǎng)基中加質量分數(shù)為100%甲醇至終質量分數(shù)為1%，連續(xù)誘導96 h。轉速為10 000 r/min，離心1 min，取上清，得粗酶液。

篩選指標分別為凝乳酶水解活力（P），凝乳活力與水解活力比值（C/P比值）及熱穩(wěn)定性，具體測定方法如下：

凝乳活性（C）的測定：采用改進的MAGDA方法[12]；

水解活力（P）的測定：采用中華人民共和國專業(yè)標準蛋白酶活力測定法SB/T10317-1999；

熱穩(wěn)定性的篩選方法：將待測樣品分別放在45℃溫度下保溫120 min，每隔10 min取樣，冰浴冷卻，在35℃下測定微小毛霉凝乳酶的剩余凝乳酶活力；以相對凝乳活力（凝乳酶加熱后與加熱前活力比值）為縱坐標，以加熱時間為橫坐標，做改造前后凝乳酶熱穩(wěn)定性比較圖。

2 結果

2.1 凝乳酶基因定點突變PCR反應

提取重組微小毛霉出發(fā)菌株質粒作為模板進行擴增。T218S，T218A，L287G的目的片段長1283bp，載體約3.6 kb，目的基因加載體總長度約4.9 kb，模板梯度稀釋，突變擴增結果如圖1所示。由圖1可以看出，T218A模板質量濃度在20，30，40 μg/mL均擴增出清晰、明亮條帶。T218S模板質量濃度在30 μg/mL和40 μg/mL擴增出條帶清晰PCR產(chǎn)物。L287G模板質量濃度在40 μg/mL擴增出條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象，與預期長度1283 bp相同，即為實驗所需。結果表明，在這四個模板濃度范圍內，三個突變PCR反應，均能得到所需PCR產(chǎn)物。隨著模板濃度的增加，PCR產(chǎn)物的亮度也有所增加，顯示產(chǎn)物的濃度也相繼增加，但是，根據(jù)PCR擴增結果，同時為了保證突變的成功率，分別選擇T218A模板質量濃度為20 μg/mL，T218S的模板質量濃度為30 μg/mL，L287G的模板質量濃度為40 μg/mL的PCR擴增產(chǎn)物用于DpnI酶切。

圖1 不同模板濃度進行定點突變PCR的擴增結果

圖1中，M為D15000 DNA分子量標準，1為模板質量濃度40 μg/mL，2為模板質量濃度30 μg/mL，3為模板質量濃度20 μg/mL，4為模板質量濃度10 μg/mL。取上述PCR產(chǎn)物和同PCR產(chǎn)物中含有相同模板濃度DNA（對照）經(jīng)DpnI酶切作用，轉入大腸肝菌DH5α，涂于含有zeocin的抗性LLB固體選擇培養(yǎng)基，結果如圖2所示。實驗組T218A，T218S，L287G均出現(xiàn)轉化子，對照組選擇培養(yǎng)基上未出現(xiàn)轉化子，證明DpnI酶對模板質粒已消除干凈。

圖2 DpnⅠ消化模板質粒轉入大腸桿菌結果

2.2 突變結果驗證

制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將PCR介導位點一步法突變得到的質粒轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取突變質粒，經(jīng)PCR及雙酶切（NotI，EcoRI）進行驗證，結果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可以看出，擴增片段1，2，3大小約為1.3 kb，與微小毛霉凝乳酶基因片段大小相一致。酶切結果同樣顯示，1，2，3得到兩條片段分別約為1.3 kb（目的片段）和3.6 kb（表達載體）。證明目的基因存在于擴增后的pPICZα A載體中。

圖3 PCR驗證結果

圖4 雙酶切驗證結果

圖3中，M為D2000 DNA分子量標準，1為T218A突變質粒，2為T218S突變質粒，3為L287G突變質粒。圖4中，M為D15000 DNA分子量標準，1～3同圖3。

將PCR、酶切鑒定后正確的質粒送至上海生物工程有限公司測序。利用DNAMAN分子生物學應用軟件將測序結果與原始凝乳酶基因和Genebank上已登錄的凝乳酶序列進行序列比對，結果如圖5所示。由圖5可以看出，218位Thr（ACC）突變?yōu)锳la（GCT）和Ser（TCC），287位Leu（CTT）突變?yōu)镚ln（CAA），除突變位點氨基酸突變正確外，未發(fā)生額外突變，證明突變成功。

圖5 基因突變測序結果

2.3 重組子的篩選

質粒梯度濃度線性化酶切后電泳結果如圖6所示。由圖6可以看出，質粒體積為6 μL和5 μL時，電泳結果顯示出現(xiàn)兩條條帶，證明質粒DNA并沒有完全線性化。當質粒體積為4 μL和3 μL時，酶切后電泳成單一條帶，大小約為5.0 kb，質粒酶切完全，成線性條帶，證明質粒DNA已經(jīng)完全線性化。為了提高酵母轉化的效率，所以選擇質粒DNA體積4 μL，作為SacI酶切作用體積。并將酶切后呈線性化的質粒DNA，采用乙醇沉淀法濃縮法得到高濃度的線性化DNA，按照酵母電轉化方法將濃縮的質粒轉入畢赤酵母細胞中，涂于YPD（含zeocin）抗性平板，30℃靜止培養(yǎng)4 d，如圖7中結果表明轉化效率較高，獲得了較多的轉化子。圖6中，M為D15000 DNA分子量標準；3～6為質粒體積分別為3，4，5，6 μL電轉化電泳結果。

圖6 不同濃度質粒線性化結果

圖7 電擊轉化結果

2.3.1 凝乳酶酶學性質篩選

突變質粒T218A，T218S，L287G轉化畢赤酵母GS115，經(jīng)YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨機挑取30個轉化子，在YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵96 h，測定粗酶液凝乳酶活力，蛋白水解活力，計算C/P比值，最終獲得上述參數(shù)優(yōu)良的轉化子各一株。結果如表3所示。

表3 突變菌株凝乳特性

由表3可以看出，T218A突變凝乳酶蛋白水解活性明顯降低最為顯著，但凝乳活性極低，不利于凝乳作用；T218S和L287G突變凝乳酶蛋白水解活性均有降低，同時二者的C/P比值均有提高，且T218S突變凝乳酶C/P比值提高幅度顯著高于L287G突變凝乳酶。

2.3.2 凝乳酶熱穩(wěn)定性篩選

本研究將初篩C/P比值較高的T218S和L287G兩個突變菌株凝乳酶進行熱穩(wěn)定性的復篩，結果如圖8所示。由圖8可以看出，T218S和L287G兩個位點的突變，均使突變凝乳酶熱穩(wěn)定性降低，均低于出發(fā)菌株。相對于L287G位突變凝乳酶，T218S位突變凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。L287G位突變凝乳酶45℃處理60 min后，相對凝乳活力降到76.4%，經(jīng)同樣熱處理，T218S位突變凝乳酶相對凝乳活力為62.0%。45℃熱處理20 min后，T218S突變凝乳酶隨著溫度處理時間的增長，相對凝乳活力持續(xù)降低，60 min后，凝乳活力降低迅速，120 min達到約40%。由此可知，T218S突變菌株凝乳酶具有更低的熱穩(wěn)定性。

圖8 45℃熱處理改造前后微小毛霉凝乳酶的熱穩(wěn)定性

3 結論

本研究在前期研究的基礎上了，設計了微小毛霉凝乳酶的分子改造方案，利用生物工程技術完成了改造工作。比較了改造前后凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及熱穩(wěn)定性，最終篩選到了突變體T218S一株，其凝乳活力、水解活力分別為52.35 U/mL和1.8 U/mL，C/P比值為29.03。相對于其他突變體及改造前微小毛霉凝乳酶，突變體T218S所產(chǎn)凝乳酶凝乳活性及C/P比值較高，熱穩(wěn)性較低，具有一定的應用前景。

[1]孟廣震.凝乳酶研究進展[J].微生物學通報,1987,14（2）：92-94.

[2]孫海蛟,呂敏,黃艾祥.我國干酪凝乳酶研究及應用現(xiàn)狀[J].中國乳業(yè),2008（5）：50-52.

[3]WANG Y,CHENG Q,AHMED Z,et al.Purification and partial characterization of milk-clotting enzyme extracted from glutinous rice wine mash liquor[J].Korean Journal of Chemical Engineering,2009,26（5）：1313-1318.

[4]YOUNG J W,WADESON A,GLOVER D J,et al.The extracellular acid protease of Yarrowia lipolytica：sequence and pH-regulated transcription[J].Microbiology,1996,142：2913-2921.

[5]YU P,CHOU C.Factors Affecting the Growth and Production of Milk-Clotting Enzyme by Amylomyces rouxii in Rice Liquid Medium[J].Food Technology and Biotechnology,2005,43（3）：283-288.

[6]CLAUDIA M,MARIA L P,CRISTINA M,et al.Structural aspects of the Mucor bacilliformis proteinase,a new member of the aspartyl-proteinase family[J].Journal of Biotechnology,2006,123：443-452.

[7]PARK Y N,AIKAWA J,NISHIYAMA M,et al.Site-Directed Mutagenesis of Conserved Trp39 in Rhizomucor pusillus Pepsin：Possible Role of Trp39 in Maintaining Tyr75 in the Correct Orientation for Maximizing Catalytic Activity[J].The Japanese Biochemical Society,1997,121（1）：118-121.

[8]AIKAWA J,PARK Y N,SUGIYAMA M,et al.Replacements of Amino Acid Residues at Subsites and Their Effects on the Catalytic Properties of Rhizomucor pusillus Pepsin,an Aspartic Proteinase from Rhizomucor pusillus[J].The Japanese Biochemical Society,2001,129（5）：791-794.

[9]姜媛媛，王景會，李玉秋，等.微小毛霉凝乳酶基因的克隆與表達.中國乳品工業(yè)，2010,38（2）：7-9.

[10]李玉秋，王景會，李鐵柱，等.重組微小毛霉凝乳酶的發(fā)酵條件及其酶學性質.食品科學，2010,31（19）：225-230.

[11]LI T,WANG J,LI Y,et al.Stucture of the complex between Mucor pusillus pepsin and the key domain of κ-casein for site-directed mutagenesis：a combined molecular modeling and docking approach[J].Journal of molecular modeling,2011,17（7）：1661-1668.