王端，周鴻翔，王曉丹，邱樹毅，田婭玲

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽550025）

0 引言

葛根是一種營養(yǎng)價值豐富的藥食兩用植物，其主要有效成分為黃酮類物質(zhì)，該物質(zhì)具有解酒、降血脂、維護心腦血管以及增強機體免疫力等多種生理功能，此外葛根中還含有大量的淀粉，一定量的礦物質(zhì)、微量元素、維生素和多種氨基酸等，具有解表退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功能[1,2]。核桃多肽從生理功能來說，優(yōu)于氨基酸和蛋白質(zhì)，不僅能提供人體生長、發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還具有調(diào)節(jié)人體機能等多種生理功能[3]，目前多肽產(chǎn)品的研制備受人們的關(guān)注。本研究以葛根和核桃餅粕為主原料，選用乳酸菌作為發(fā)酵菌種，再經(jīng)發(fā)酵液與一定比例的多肽粉混合，研制出一種新型的乳酸發(fā)酵型葛根核桃肽復(fù)合飲料，將原料的保健及營養(yǎng)作用融合在一起的同時，綜合了乳酸發(fā)酵的怡人香味以及葛根、核桃原有的風(fēng)味，構(gòu)成了乳酸發(fā)酵型葛根核桃肽飲料的獨特風(fēng)味。該飲料的研制符合新型功能性營養(yǎng)食品的發(fā)展方向。

1 實驗

1.1 材料與試劑

葛根（市售優(yōu)質(zhì)干葛根）；核桃餅粕、核桃脫脂粉（實驗室自制）；保加利亞乳桿菌、乳酸乳球菌乳脂亞種；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品；蔗糖、白砂糖、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、藻酸丙二醇酯、蔗糖酯皆為食品級；α-淀粉酶；糖化酶；中性蛋白酶；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

1260高效液相色譜儀，DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機，F(xiàn)A2004N電子天平，BOXUN立式壓力蒸汽滅菌器，JJ-CJ無菌超凈工作臺，ZHWY-111B落地普通型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器，7DL-40B臺式離心機，ATN-300全自動凱氏定氮儀，723N可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合飲料的制備工藝流程

葛根粉→酶解→添加核桃餅粕、蔗糖→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→發(fā)酵液→添加核桃多肽粉→調(diào)配→殺菌→成品。

1.3.2 操作要點

（1）葛根淀粉的酶解。90℃水浴30 min后加入液化酶，加入量為40 U/g，調(diào)節(jié)pH為6.0，在60℃下水浴酶解60 min，然后加入糖化酶，加入量為160 U/g，調(diào)節(jié)pH值為4.0，在60℃條件下水浴60 min。

（2）多肽粉的制備。由之前研究可知，脫脂核桃粕[4]用中性蛋白酶酶解，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后多肽提取率可達0.45 g/g，將該酶解液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃下濃縮至原體積的30%左右，冷凍干燥后即得粗制核桃多肽粉。

（3）多肽粉的添加?；诎l(fā)酵乳飲料對蛋白質(zhì)含量的要求，并從成本和口感的角度考慮，最終確定在發(fā)酵液中添加1.5%多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66%的粗制多肽粉。

（4）調(diào)配。為了得到穩(wěn)定且口感優(yōu)良的乳酸發(fā)酵型葛根核桃肽復(fù)合飲料，確定穩(wěn)定劑的添加量為黃原膠0.11%，羧甲基纖維素鈉0.10%，藻酸丙二醇酯0.17%，蔗糖酯0.14%。此外，白砂糖的添加量8%，檸檬酸0.1%，食用香精0.08%。（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）

（5）殺菌。將制得的復(fù)合飲料于90℃下滅菌10 min，即得最終產(chǎn)品。

1.3.3 葛根核桃復(fù)合發(fā)酵液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的葛根粉于三角瓶中，加入液化酶和糖化酶酶解后，按1∶1的原料比加入核桃餅粕，固液比為1:10，攪拌均勻，在85℃下滅菌15 min，冷卻到35℃左右按1∶1的比例接入保加利亞乳桿菌和乳酸乳球菌，37℃，120 r/min下培養(yǎng)2 d，離心后進行感官評分并測定其黃酮提取率。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

蛋白質(zhì)的測定GB5009.5-2010；脂肪的測定GB/T5009.6-2003；酸度的測定 GB541334-2010；多肽的測定雙縮脲法[5]；黃酮的測定HPLC法[6]。

1.3.5 黃酮的測定

以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品，采用HPLC法測定發(fā)酵液中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

（1）色譜條件。Agilent1260高效液相色譜儀，采用SB-C18反相色譜柱(內(nèi)徑4.6mm×250mm，粒徑5 μm)，檢測器波長250 nm，柱溫30℃，分析時間10.2 min，流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，流動相甲醇∶水=30∶70。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確稱取于80℃烘干至恒重的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%甲醇溶解，定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1，2，3，4，5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶，用25%甲醇定容，分別配制成質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列，現(xiàn)配現(xiàn)用。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品的測定。將制得的發(fā)酵液于轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心20 min，定容后取上層清液5 mL真空濃縮至干，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%甲醇水溶液溶解并定容至10mL，測定之前用0.22 μm微孔濾膜過濾。將樣品的峰面積數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=AX+B，即可求出樣品中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 黃酮提取率（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的計算

黃酮提取率（mg/g）=發(fā)酵液中黃酮的質(zhì)量/葛根的質(zhì)量，

黃酮質(zhì)量濃度=樣品中黃酮的質(zhì)量/樣品的體積。

1.3.7 葛根核桃蛋白發(fā)酵液感官評定

請10位有經(jīng)驗的實驗室技術(shù)人員，根據(jù)葛根核桃復(fù)合發(fā)酵液的乳清析出情況、沉淀情況、口感、風(fēng)味等多方面進行綜合評分，取其平均值作為最后的感官評分（百分制），評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 復(fù)合發(fā)酵飲料的評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：y=84.782x+50.276，R2=0.9995，表明在葛根素質(zhì)量濃度為20～100 mg/L的范圍內(nèi)，曲線的線性關(guān)系很好。葛根素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜

2.2.1 原料配比對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作如同1.3.3，其中核桃餅粕與葛根的比例分別為3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，實驗結(jié)果如圖2所示。由圖1可以看出，隨著葛根添加量的增大，黃酮提取率和感官評分均逐漸增大，綜合考慮，選擇1:2為核桃餅粕和葛根的最佳原料配比。

圖2 原料配比對黃酮提取率和感官評分的影響

2.2.2 蔗糖添加量對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作同1.3.3，其中核桃餅粕與葛根的比例為1:2，蔗糖的添加量分別為0%，0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著蔗糖添加量的增大，黃酮提取率先增大后減小，感官評分逐漸增大，這是因為，隨著蔗糖的增加，飲料的甜味增加，酸甜比更加適宜，但是過多的糖對微生物生長會產(chǎn)生抑制效應(yīng)，不利于產(chǎn)物的生成。因此，蔗糖的最適添加量為1%。

圖3 蔗糖添加量對黃酮提取率和感官評分的影響

2.2.3 接種量對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作同1.3.3，其中原料配比為1:2，蔗糖添加量為1%，接種量分別為2%，4%，6%，8%，10%，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，隨著接種量的增大，在相同的時間內(nèi)消耗營養(yǎng)物質(zhì)較多，不利于產(chǎn)物的生成。綜合考慮，接種量選擇4%為最佳。

2.2.4 溫度對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作同1.3.3，其中原料配比1:2，蔗糖添加量1%，接種量4%，發(fā)酵溫度分別為35，37，39，41，43 ℃，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)溫度高于3 7℃時，不利于黃酮的提取，而溫度高于39℃時，發(fā)酵液有異味。因此，選擇37℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2.5 發(fā)酵時間對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作同1.3.3，其中原料配比1:2，蔗糖添加量1%，接種量4%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3 d，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，黃酮提取率逐漸增大，但2 d后，增大不明顯，且發(fā)酵液出現(xiàn)明顯異常的酸味。綜合考慮，發(fā)酵時間選擇2 d為最佳。

圖4 接種量對黃酮提取率和感官評分的影響

圖5 發(fā)酵溫度對黃酮提取率和感官評分的影響

2.2.6 固液比對黃酮提取率和感官評分的影響

實驗操作同1.3.3，其中原料配比1∶2，蔗糖添加量1%，接種量4%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間2 d，固液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，隨著液體的增多，黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)液體大于15 mL/g時，黃酮提取率增大不明顯且發(fā)酵液的風(fēng)味變淡。因此，最佳固液比為1∶15。

2.3 正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇影響較大的原料配比、接種量、溫度三因素為考察因素進行L9(33)的正交試驗，其因素水平表如表2所示，并以黃酮提取率（mg/g）和感官評分為評價指標(biāo)篩選最佳工藝條件。黃酮提取率和感官評分的正交試驗直觀分析分別如表3和表4所示。

圖7 固液比對黃酮提取率和感官評分的影響

表2 因素水平

表3 L9(33)黃酮提取率正交試驗直觀分析

由表3可以看出，影響黃酮提取率的因素順序為：原料配比＞溫度＞接種量，以原料配比的影響最大，極差分析的最佳發(fā)酵工藝條件為A3B2C3。由表4可以看出，影響感官評分的因素順序為：接種量＞原料配比＞溫度。與黃酮提取率的正交優(yōu)化結(jié)果相比，雖然影響的主次因素不同，但提取的最佳工藝仍為A3B2C3。因此，以黃酮提取率和感官評分為指標(biāo)的最佳發(fā)酵工藝條件為原料配比1∶3，接種量4%，溫度39℃，蔗糖添加量1%，固液比1∶15，發(fā)酵時間2 d。在此條件下所制備的葛根核桃復(fù)合飲料口感較好，黃酮提取率達3.812 mg/g。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.4.1 感官指標(biāo)

色澤偏黃，均勻一致，酸甜適口，口感細膩、柔和，粘稠適中，無分層及沉淀現(xiàn)象，既有濃郁的乳酸菌發(fā)酵風(fēng)味，又兼有葛根的清香和核桃的香味，無任何異味。

表4 L9(33)感官評分正交試驗直觀分析

2.4.2 理化指標(biāo)

蛋白質(zhì)1.25%；多肽12 mg/mL；酸度77 °T；脂肪1.1%；黃酮0.2 mg/mL；穩(wěn)定劑等符合GB2760-2011食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；重金屬含量低于國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.3 微生物指標(biāo)

細菌總數(shù)≤100 mL-1；大腸菌群（最近似值）≤0.03 mL-1；霉菌≤10 mL-1；酵母≤10 mL-1；致病菌未檢出。

3 結(jié)論

以葛根和核桃餅粕為原料，選用乳酸菌發(fā)酵，以黃酮提取率和感官評分為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇原料配比、接種量、溫度三因素為考察因素進行L9(33)的正交實驗，最終確定最佳發(fā)酵工藝條件：核桃餅粕∶葛根=1∶3，接種量4%，蔗糖添加量1%，固液比1∶15，發(fā)酵溫度39℃，發(fā)酵時間2 d，在此條件下所制備的復(fù)合飲料口感較好，黃酮提取率達3.812 mg/g。經(jīng)調(diào)配的乳酸發(fā)酵型葛根核桃肽復(fù)合飲料穩(wěn)定性好，酸甜適宜，香味獨特。

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