姜一銘，韓建春

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引言

嗜冷菌：0～7℃下能夠生長(zhǎng)，并在7～10 d內(nèi)產(chǎn)生可見菌落的微生物[1]。當(dāng)原料奶在3～5℃儲(chǔ)存一段時(shí)間再加工時(shí)，嗜冷菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶和脂肪酶的幾率加大，使得U H T奶產(chǎn)生劣變，導(dǎo)致風(fēng)味發(fā)生變異，最終縮短產(chǎn)品保質(zhì)期。在140℃滅菌5 s，蛋白酶和脂肪酶的殘留量也會(huì)達(dá)到30%以上，導(dǎo)致苦味、凝塊，腐爛味和酵母味。在長(zhǎng)期貯存后會(huì)使牛奶變苦Law等人[2]得出結(jié)論，當(dāng)乳在滅菌前接種的假單胞菌的數(shù)量達(dá)到5.0×107mL-1和8.0×106mL-1，滅菌乳在20℃的貯存條件下分別在12天和9個(gè)星期后出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象[3]。本研究是通過控制原料奶中的嗜冷菌數(shù)，測(cè)定蛋白酶和脂肪酶活力，明確引起生鮮乳變質(zhì)的嗜冷菌的生物學(xué)特性，研究其生長(zhǎng)代謝規(guī)律以便有效對(duì)其進(jìn)行控制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

微生物常規(guī)檢驗(yàn)設(shè)備，生化培養(yǎng)箱（LRH-250），立式蒸汽壓力滅菌器（LDZX-40BI），實(shí)驗(yàn)室水純化系統(tǒng)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A），紫外分光光度計(jì)（UV-3802S），酸度計(jì)（DELTA320）。

1.1.2 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）A.S1086 和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）ATCC 10028由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供。

自分離菌株及來源：選擇哈爾濱市周邊的6個(gè)牧場(chǎng)，從2013年9月份到2014年6月份，平均每15 d左右取一次奶樣，每天分早、中、晚三次釆樣。著重對(duì)牧場(chǎng)原料乳的菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.1.3 培養(yǎng)基

選擇乳平板計(jì)數(shù)瓊脂（MPC瓊脂milk plate count agar）對(duì)牧場(chǎng)采集的原料乳進(jìn)行嗜冷菌的分離和培養(yǎng)。所用的稀釋液為蛋白胨-鹽溶液。

1.2 方法

整個(gè)檢驗(yàn)過程和檢測(cè)方法參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測(cè)定》（NY/T 1331-2007）。

1.2.1 菌株的分離和培養(yǎng)

采用稀釋傾注平板法與平板劃線分離結(jié)合的方法，分離純化原料乳中的嗜冷菌。單菌落分離純化數(shù)次后，結(jié)合革蘭氏染色進(jìn)行嗜冷菌篩選[5]。將獲得的單個(gè)菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）上7℃培養(yǎng)5 d，擴(kuò)大培養(yǎng)，觀察菌落特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色觀察和觀察細(xì)菌動(dòng)力。將菌株于15℃培養(yǎng)7 d，用紫外光源（253.7 nm型）觀察熒光色素產(chǎn)生情況。將各菌種進(jìn)行需氧性試驗(yàn)，同時(shí)置于厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)和空氣中培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h后觀察生長(zhǎng)情況。

將經(jīng)涂片染色鏡檢確定為純培養(yǎng)物后的菌株制備[6，7]，進(jìn)行分離菌株的生理生化試驗(yàn)[8，9]，結(jié)合梅里埃生化鑒定套裝對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。并選取部分有代表性的菌株進(jìn)行16 S rRNA序列分析，為確定菌種的分類學(xué)地位提供依據(jù)，從遺傳學(xué)角度對(duì)菌株進(jìn)行確證。

1.2.2 人為污染后UHT乳的加工

將本試驗(yàn)中自分離出銅綠假單胞菌和藤黃微球菌混合培養(yǎng)，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，然后人為污染滅菌乳，灌裝后進(jìn)行UHT乳生產(chǎn)，并對(duì)其菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。分析不同濃度的嗜冷菌對(duì)UHT乳貨架期的影響。

（1）人為污染

將嗜冷菌菌液稀釋成不同的濃度，一共25組原料奶試驗(yàn)樣品。再將準(zhǔn)備好的嗜冷菌液按要求添加量加入各處理組的原料乳樣中，迅速將配制好的乳樣于4℃冷藏20 h（還原生鮮奶從收購(gòu)到進(jìn)入乳品廠進(jìn)行生產(chǎn)的時(shí)間，這期間嗜冷菌會(huì)代謝產(chǎn)生一些酶類），冷藏后對(duì)這25組樣品進(jìn)行菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)的計(jì)數(shù)，然后這25組樣品用于生產(chǎn)UHT乳。

（2）UHT乳的加工

調(diào)配好的25組原料乳樣（冷藏于4℃冰箱），依次進(jìn)行UHT處理（135℃、4 s）無菌灌裝（每組灌裝200 mL 40瓶），將UHT乳樣置于不同溫度下貯藏。每周2次測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)（測(cè)試頻次依據(jù)試驗(yàn)后期視具體情況而確定），預(yù)測(cè)產(chǎn)品的貨架期。

1.2.3 保溫實(shí)驗(yàn)

分別取各組6瓶UHT乳樣于37℃保溫7 d，并于第3天、第7天取樣進(jìn)行酒精試驗(yàn)、煮沸試驗(yàn)和感官評(píng)定，有絮狀物者定義為陽性，用“+”表示，反之為陰性，用“-”表示。

1.2.4 貨架期的判定

以UHT乳樣品的感官評(píng)分為輔助指標(biāo)，煮沸試驗(yàn)、酒精試驗(yàn)作為最終判定產(chǎn)品貨架期的主要指標(biāo)。

（1）煮沸試驗(yàn)，取乳樣10 mL于試管中，置沸水浴中加熱5 min后觀察，不得有凝塊或絮片狀物產(chǎn)生，否則表示乳不新鮮，而且其酸度大于26°T。

（2）酒精試驗(yàn)，在試管內(nèi)用等量的中性酒精和牛乳混合（一般用1～2 mL等量混合），在20℃下檢測(cè)奶樣，振搖后不出現(xiàn)絮片的牛乳，表明其酸度低于18°T，此乳為新鮮乳，如出現(xiàn)絮片，則表明酸度高于18°T，此乳為次鮮或變質(zhì)乳。

1.2.5 感官指標(biāo)的檢測(cè)

針對(duì)性的對(duì)UHT處理后的牛乳進(jìn)行不同程度的嗜冷菌的污染，放置不同的時(shí)間。對(duì)牛乳的感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，以苦味值作為檢測(cè)指標(biāo)，并通過失穩(wěn)值對(duì)產(chǎn)品狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算公式如下：

苦味值（‰）=50%以上的評(píng)定人員確定的苦味樣品數(shù)/樣品總量×1000；

失穩(wěn)值（%）=苦味產(chǎn)品中出現(xiàn)明顯的意味、變色或凝膠等狀態(tài)的產(chǎn)品數(shù)/苦味產(chǎn)品總量×100；

酶活力：在上述條件下，以每分鐘分解底物（橄欖油）釋放出μmol游離脂肪酸所需要的酶量定義為：一個(gè)酶活力國(guó)際單位（IU），以IU/mL表示。檢測(cè)蛋白酶活性（采用Folin-酚試劑法）、脂肪酶活性（按QB/T1803-93A4方法）[10]。

培養(yǎng)液pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別設(shè)定不同pH值的培養(yǎng)液初始濃度，進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，定期取樣測(cè)定其中的酶活力。

IU/mL={[樣品NaOH的消耗量（mol）－空白NaOH的消耗量（mol）]×106}/[10（min）×1（mL）]。

培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別在5，20，30℃各個(gè)條件下培養(yǎng)目標(biāo)菌種，定期取樣測(cè)定其中的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 自分離菌株的分離和純化

依據(jù)農(nóng)業(yè)部的標(biāo)準(zhǔn)，在低溫環(huán)境下對(duì)原料乳中的嗜冷菌進(jìn)行篩選、分離，挑取菌落形態(tài)有差異的菌落進(jìn)行進(jìn)一步分析。分離出10株能適應(yīng)低溫條件的菌株形態(tài)，考慮將其作為目的菌株，進(jìn)行生化鑒定。低溫篩選的菌落特征如表2所示。

表2 低溫篩選的菌落特征

根據(jù)自分離菌株的生理生化特征，將其歸納為以下幾個(gè)屬。

菌株編號(hào)：NO.4，6，8，9，10為假單胞菌屬（Aeromonas），大?。?.5-1）～（1.5-4）μm。專性需氧，平板劃線培養(yǎng)3 d后菌落呈扁平的圓形，菌落透明，表面光滑有光澤，邊緣整齊，稍有隆起、溫潤(rùn)、呈白色。大多數(shù)菌的適溫為30℃。普遍存在于土壤、淡水、海水中。端生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。

菌株編號(hào)：NO.1，3，7為微球菌屬（Lactococcus），直徑0.5～2.0 μm，成對(duì)、四聯(lián)或成簇出現(xiàn)，但不成鏈。兼性厭氧，罕見運(yùn)動(dòng)，無莢膜，無芽胞，菌落表面光滑，稍突起，奶油白色?？稍?4～24℃生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25～37℃。最適pH=7。最初出現(xiàn)在脊椎動(dòng)物皮膚和土壤，但從食品和空氣中也常常能分離到。

菌株編號(hào)：NO.2，5為產(chǎn)堿桿菌屬（Flavobacterium），常成單、雙或成鏈狀排列，周生鞭毛，無芽胞，不運(yùn)動(dòng)，多數(shù)菌株無莢膜。大小1.5～4.2 μm，專性需氧，可在3～41℃生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度25～37℃，在胰蛋白瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣整齊，有光澤、濕潤(rùn)、豐滿。最適pH值為5～7。

2.2 菌落總數(shù)對(duì)UHT乳貨架期的影響

各個(gè)牧場(chǎng)的菌落總數(shù)各不相同，最高的約4.2×103mL-1，最低的2.0×103mL-1（數(shù)據(jù)略）。

原料乳的細(xì)菌總數(shù)和嗜冷菌的含量對(duì)UHT乳貨架期有重要的影響，由于嗜冷菌的污染造成UHT乳品質(zhì)劣變的狀況不容忽視。當(dāng)菌落總數(shù)和嗜冷菌含量很高時(shí)，UHT乳的貨架期最短，菌落總數(shù)為3.7×106mL-1，嗜冷菌數(shù)為2.9×106mL-1商品的貨架期僅42 d，貨架期小于50 d的實(shí)驗(yàn)樣品，兩項(xiàng)指標(biāo)中會(huì)有一項(xiàng)居高不下。隨著嗜冷菌含量下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，商品的貨架期均延長(zhǎng)至60 d以上，原料乳中嗜冷菌的數(shù)量或蛋白酶、脂肪酶的活性與對(duì)應(yīng)生產(chǎn)的產(chǎn)品的貨架期呈負(fù)相關(guān)。表3為菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)對(duì)UHT乳貨架期的影響。

表3 菌落數(shù)對(duì)UHT乳貨架期的影響

2.3 人為污染后嗜冷菌對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響

人為污染后灌裝，進(jìn)行UHT乳生產(chǎn)，分析嗜冷菌和其代謝產(chǎn)生的耐熱酶對(duì)UHT乳貨架期的影響，通過控制原料奶中嗜冷菌數(shù)、測(cè)定蛋白酶和脂肪酶活力對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行綜合判斷，建立酶活力與UHT奶品質(zhì)的相關(guān)性比單一研究嗜冷菌與產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系更直接有效。圖1為嗜冷菌污染對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響。

圖1 嗜冷菌污染與產(chǎn)品苦味值之間的關(guān)系

由圖1可以看出，產(chǎn)品發(fā)生劣變與嗜冷菌受污染程度呈正相關(guān)，當(dāng)嗜冷菌污染程度由低到高，產(chǎn)品的苦味值大大增加，貯存時(shí)間越長(zhǎng)差異越明顯。這在存放的前三個(gè)月內(nèi)變化不明顯，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，污染數(shù)量高的樣品苦味值開始發(fā)生變化，當(dāng)貯存時(shí)間達(dá)到8個(gè)月時(shí)，嗜冷菌污染數(shù)量為1 000 mL-1和10 000 mL-1的樣品的苦味值變化不十分明顯，而嗜冷菌污染數(shù)量為100 000 mL-1的樣品的苦味值已經(jīng)達(dá)到2%以上，兩者相差將近10倍。原料乳污染嗜冷菌程度的大小對(duì)UHT奶的品質(zhì)，從存放5個(gè)月后對(duì)樣品的影響更為顯著，所以貨架期5個(gè)月是控制產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，因此控制嗜冷菌數(shù)對(duì)UHT奶的品質(zhì)至關(guān)重要。

2.4 脂肪酶和蛋白酶對(duì)UHT乳苦味值的影響

通過測(cè)定嗜冷菌代謝產(chǎn)生的酶的活力，分析酶活力和產(chǎn)品發(fā)生劣變的關(guān)系。由圖2和圖3可以看出，酶活力對(duì)產(chǎn)品苦味值有一定的影響。消毒處理之前蛋白酶和脂肪酶活力強(qiáng)的UHT奶樣品在長(zhǎng)期保存時(shí)，出現(xiàn)苦味的幾率大大增加，說明牛乳即使經(jīng)過UHT處理，蛋白酶和脂肪酶的活性還有一定殘留，造成蛋白與脂肪在貯存過程中被酶水解，導(dǎo)致苦味的產(chǎn)生。

圖2 脂肪酶活力對(duì)UHT乳制品苦味值的影響

圖3 蛋白酶活力對(duì)UHT奶苦昧值的影響

運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的方差分析功能，對(duì)嗜冷菌數(shù)、蛋白酶和脂肪酶活力這三種因素對(duì)存放8個(gè)月內(nèi)的UHT奶的苦味值的影響進(jìn)行差異顯著性多種比較，結(jié)果如表4所示。這三種因素對(duì)苦味值影響的結(jié)果是顯著不同的。多重均值測(cè)驗(yàn)結(jié)果說明，隨著嗜冷菌數(shù)的升高，苦味值增加，在嗜冷菌數(shù)為1 000 mL-1和10 000 mL-1時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.2，說明隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，該濃度下的嗜冷菌數(shù)對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異不顯著（P＞0.05），但當(dāng)嗜冷菌數(shù)達(dá)到100 000 CFU/ml時(shí)，對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異顯著（P＜0.05）。脂肪酶活力達(dá)到10U/mL，對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異顯著（P＜0.05），而在2 U/mL和5 U/mL濃度下，對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異不顯著（P＞0.05）。蛋白酶活力在5 U/mL時(shí)，對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異不顯著（p＞0.05），當(dāng)濃度提高到15 U/mL和25 U/mL時(shí)，對(duì)產(chǎn)品苦味值的影響差異顯著（P＜0.05）。

表4 不同因素對(duì)產(chǎn)品存放8個(gè)月后產(chǎn)品苦味值的影響

見表5，苦味的產(chǎn)生主要是由酶類水解脂肪和蛋白質(zhì)形成的。隨著苦味值的增加，組織狀態(tài)也發(fā)生變化，且在苦味值較大時(shí)，這種現(xiàn)象更為明顯。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品即使沒有苦味時(shí)，組織狀態(tài)也可能出現(xiàn)變化，如形成凝膠、變粘稠、產(chǎn)生異味等。因此在UHT奶貯存過程中，蛋白酶與脂肪酶對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)影響比較顯著。由于嗜冷菌的污染造成UHT奶品質(zhì)劣變的狀況不容忽視。原料乳中嗜冷菌的數(shù)量或蛋白酶、脂肪酶的活性與產(chǎn)品長(zhǎng)期保存時(shí)的品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。因此原料奶中嗜冷菌數(shù)必須得到控制，通過測(cè)定蛋白酶和脂肪酶活力來對(duì)原料奶的品質(zhì)進(jìn)行分級(jí)和評(píng)價(jià)是很有必要的。

表5 苦味值與產(chǎn)品組織狀態(tài)的關(guān)系

圖4 pH值對(duì)酶活力的影響

由圖4可以看出，各個(gè)梯度pH值均有產(chǎn)酶峰值出現(xiàn)，pH值為6.2～7.2時(shí)，蛋白酶的活力較高。脂肪酶的最適pH值與蛋白酶相比略向堿性條件偏移，但pH 6.3時(shí)，仍然保留著50%以上的最大酶活力，因此，原料乳的貯存pH值對(duì)蛋白酶和脂肪酶活性的發(fā)揮有促進(jìn)，這將對(duì)UHT奶的長(zhǎng)期貯存帶來不利影響。

各個(gè)溫度下培養(yǎng)均有產(chǎn)酶峰值出現(xiàn)，見圖5，原料奶的貯存溫度對(duì)蛋白酶活力的影響比較大，即使在3～5℃的低溫條件下，蛋白酶仍具有一定的活性，脂肪酶具有約50%的酶活力。蛋白酶的活性比較高出現(xiàn)在25～30℃。隨著溫度的增高，酶活性迅速降低。由于脂肪酶在常溫下活性發(fā)揮的更好，因此常溫保存更有利于脂肪酶發(fā)揮活性，因此可以通過殺菌等熱處理方式降低酶的活性。

圖5 溫度對(duì)酶活力的影響

3 結(jié)果與討論

（1）從對(duì)6個(gè)農(nóng)場(chǎng)的原料乳的10個(gè)月的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，嗜冷菌的平均值為3.2×103mL-1，略高于嗜冷菌的控制目標(biāo)值1×103mL-1，所以各個(gè)牧場(chǎng)在對(duì)嗜冷菌的控制上均存在一定的問題。

（2）季節(jié)變化對(duì)嗜冷菌數(shù)的控制影響較大，氣溫較高的月份嗜冷菌數(shù)明顯下降，氣溫較低時(shí)嗜冷菌數(shù)較高，推斷嗜冷菌的生長(zhǎng)與氣溫有一定關(guān)系。內(nèi)部管理水平較高，且自動(dòng)化程度較高的牧場(chǎng)，在溫度較高的月份嗜冷菌的數(shù)量低于目標(biāo)控制值1×103mL-1，說明嗜冷菌的污染與環(huán)境有一定的關(guān)系。

（3）分離出的嗜冷菌在生長(zhǎng)情況良好時(shí)形態(tài)各異，以革蘭氏陰性菌居多，由此推測(cè)與腸道菌有一定的聯(lián)系，所以控制一定數(shù)量的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)設(shè)計(jì)有效的冷藏期限和對(duì)加工工藝的評(píng)價(jià)有很大的價(jià)值。

（4）人為污染嗜冷菌后灌裝進(jìn)行UHT乳生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)嗜冷菌的原始數(shù)量或蛋白酶、脂肪酶的活性與產(chǎn)品長(zhǎng)期保存時(shí)的品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

（5）UHT處理牛乳后，殘留的蛋白酶和脂肪酶會(huì)將乳中的蛋白和脂肪水解，產(chǎn)品發(fā)生劣變，苦味值也隨之增加。

（6）原料乳的貯存pH值對(duì)蛋白酶和脂肪酶活性的發(fā)揮有促進(jìn)，這將對(duì)UHT奶的長(zhǎng)期貯存帶來不利影響。

嗜冷菌污染是現(xiàn)代乳制品加工過程中比較常見的問題，應(yīng)盡量縮短原料乳的貯藏時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)藏能產(chǎn)生耐熱的酶類從而導(dǎo)致乳及乳制品風(fēng)味、品質(zhì)降低，縮短保質(zhì)期，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量及加工過程的順利進(jìn)行。因此，可以通過適當(dāng)延長(zhǎng)殺菌時(shí)間、或采用適當(dāng)?shù)那爸脽崽幚淼仁侄蝸碜畲蟪潭鹊臏缁蠲?，以確保產(chǎn)品的最終品質(zhì)。同時(shí)搞好企業(yè)質(zhì)量管理，防止生乳被嗜冷菌污染從而控制生乳中嗜冷菌的數(shù)量、控制其蛋白酶和脂酶的分泌；了解蛋白酶和脂酶的特性，從而有針對(duì)性的采取相應(yīng)的措施。這對(duì)于提高乳制品品質(zhì)，延長(zhǎng)保質(zhì)期，具有重要的意義。

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